雜合抗菌肽的設(shè)計改造、真核表達(dá)及性質(zhì)研究.pdf

1、抗菌肽因其殺菌的高效性、廣譜性和不易產(chǎn)生耐藥性等特點受到廣泛關(guān)注，在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。雜合抗菌肽是一類新型抗菌肽，它由來自兩種或多種抗菌肽的部分肽鏈組成，具有高效、廣譜、低毒、肽鏈較短等特點。人工設(shè)計雜合肽是研究的熱點之一，即選擇一種抗菌肽為藍(lán)本，對某些氨基酸做刪減替換或與另外一種抗菌肽的片段拼接。研究表明，一些經(jīng)過的改造的抗菌肽具有與藍(lán)本相似或更高的活性，毒酣作用降低，而且變短的肽鏈為降低合成成本也奠定了基礎(chǔ)。為了

2、解決抗菌肽直接提取純化困難、化學(xué)合成法的成本較高、原核表達(dá)產(chǎn)物可能導(dǎo)致活性喪失并對宿主有害且難以純化等問題，選擇真核表達(dá)系統(tǒng)成為基因工程表達(dá)抗菌肽的理想選擇。 因此，探索并設(shè)計新肽，改善原有抗菌肽的活性，降低或消除他們的溶血性，高效表達(dá)目的小肽對解決目前抗菌肽存在的問題都有著重要的意義和實驗價值。目前，源自不同藍(lán)本的雜合抗菌肽研究頗多，從不同方面達(dá)到或接近了預(yù)期效果；其中David等做了CecropinA和Melittin不同片

3、段的拼接，成功的篩選到了幾種肽鏈變短而活性較強(qiáng)的雜合肽，CAq(1-7)M(4-11)就是其中的一個；鑒于還未見CB(1-7)M(4-11)的報道，本實驗開展了以下研究： 1、雜合抗菌肽的設(shè)計及真核表達(dá)載體的構(gòu)建。在雜合抗菌肽CA(1-7)M(4-11)的基礎(chǔ)上，設(shè)計了新肽CB(1-7)M(4-11)，即由Cecropin B成熟肽N端1-7位氨基酸與Melittin成熟肽N端4-11位氨基酸拼接而成，與CA(1-7)M(4-1

4、1)相比，肽鏈的第四位由纈氨酸取代亮氨酸，并對二者進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；參照畢赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)的偏好密碼子，改造并合成雜合抗菌肽CA(1-7)M(4-11)和CB(1-7)M(4-11)基因，利用SOE法克隆雜合抗菌肽基因，最后將正確的基因序列與pPICZa-A構(gòu)建表達(dá)載體，并通過酶切驗證和再次測序。 2、雜合抗菌肽CA(1-7)M(4-11)和CB(1-7)M(4-11)的真核表達(dá)，電轉(zhuǎn)化及表達(dá)條件優(yōu)化。

5、本章將pPICZa-A-CA(1-7)M(4-11)和pPICZa-A-CB(1-7)M(4-11)轉(zhuǎn)化了巴德畢赤酵母Pichia pastoris X-33，成功獲得了工程菌；經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和小肽SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示蛋白分子量約為2.0kD，與預(yù)計相符；優(yōu)化了電轉(zhuǎn)方案，在7μg質(zhì)粒、2cm電轉(zhuǎn)杯的情況下，宿主菌P.pastoris X-33 OD<,600>=1．0、電壓為2000V、復(fù)蘇2h時能取得最佳效果；優(yōu)化了表達(dá)條件，在

6、OD<,600>=6.0時轉(zhuǎn)入BMMY、0.5％甲醇誘導(dǎo)、26℃培養(yǎng)、48h收獲的條件下，兩種雜合肽的表達(dá)量可達(dá)125μg/mL和128μg/mL；此外，工程菌也顯示出很好的遺傳穩(wěn)定性。 3、雜合抗菌肽CA(1-7)M(4-11)和CB(1-7)M(4-11)的活性、效價、穩(wěn)定性、抗菌譜及溶血性測定。實驗結(jié)果表明，列Ecoli、P．a(chǎn)eruginosa、K．pneumoniae和B.subtilis而言，CA-M的活性高于CB-

7、M；對S.aureus、Salmonelladerby而言，CB-M則稍高于CA-M；兩者對B．thuringiensis的抗性差別不大；兩種雜合肽都具有較高的熱穩(wěn)定性，在中性偏酸的環(huán)境中活性較高，堿性環(huán)境中受到抑制；堿性環(huán)境中隨著pH值逐漸增大，CB-M的活性受抑制程度沒有CA-M強(qiáng)烈；兩種雜合肽在檢測的濃度范圍內(nèi)沒有表現(xiàn)出溶血性，CB-M也消除了Melittin本身較強(qiáng)的溶血性。對雜合抗菌肽的預(yù)測和實驗結(jié)果分析表明，a-螺旋是抗菌肽