人源及雜合抗菌肽在乳酸乳球菌中重組分泌表達.pdf

1、背景：
　　目前，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細菌的抗生素耐藥率及耐藥譜正得到快速增加和擴展，現(xiàn)有的基于微生物種間作用產(chǎn)生的抗生素類抗菌藥物將面臨前所未有的危機[1]。另外腸道菌群平衡與人體健康有著密切關(guān)系，當(dāng)菌群失調(diào)時會導(dǎo)致宿主多種疾病的發(fā)生，尤其是腸道疾病，如腹瀉、IBD等[2]。抗菌肽(Antibacterialpeptides)又叫抗微生物肽(Antimicrobial peptides，AMPs)，是由多種生物細胞特定基因編碼

2、經(jīng)外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有廣譜抗細菌、真菌、病毒、原蟲、抑殺腫瘤細胞等活性作用的多肽，但對于人體有益菌則無明顯抑菌效果。它作為天然免疫系統(tǒng)的重要組成成分，同時因其廣譜抑菌活性和不易產(chǎn)生耐藥性的特性，可能成為一種新的控制感染和調(diào)節(jié)腸道菌群的有效途徑[3]。如今已確認被收錄入數(shù)據(jù)庫的抗菌肽數(shù)目就達到1500多種，種類來源包括細菌、植物、昆蟲、兩棲動物、無脊椎動物、哺乳動物等[4]。對于人類本身也有自身分泌的抗菌肽，目前人源類抗菌肽研究較多

3、、作用效果廣泛的有兩大家族，分別是cathelicidins家族和defensins家族。
　　LL-37是迄今為止在人體中發(fā)現(xiàn)的唯一一種Cathelicidins家族抗菌肽，廣泛存在于胃腸道和泌尿道、呼吸道等組織上皮細胞分泌的中性粒細胞中，在組織受到炎癥、感染和損傷時LL-37分泌明顯增加[5]。LL-37具有廣譜抗菌活性，對多種革蘭陽性菌、陰性菌以及真菌均有效，同時LL-37作為免疫調(diào)節(jié)因子可通過角質(zhì)細胞釋放IL-8來影響宿主

4、炎癥應(yīng)答[6]。人α防御素5(alpha human defensin-5，簡稱HD5)是防御素家族中一個重要的抗菌肽，它主要在小腸潘氏細胞中大量分泌表達，可隨著腸道中受到炎癥、感染和細胞惡性轉(zhuǎn)化等因素的刺激而上調(diào)分泌表達[7，8]。HD5不僅具有高效的廣譜抑殺病原菌活性和能在免疫調(diào)節(jié)起到保護作用，還可以抗HIV、HSV等病毒作用[9-12]。鑒于抗菌肽的多種活性功能，在研發(fā)新型抗菌藥物及協(xié)同調(diào)節(jié)免疫方面得到了更多的關(guān)注。
　　現(xiàn)

5、今，抗菌肽主要從天然資源中提取，但成本高、得率低、工序繁瑣等制約著其廣泛應(yīng)用;而化學(xué)合成法則價格相對昂貴，也難以應(yīng)用于臨床。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽則具有重要意義。乳酸菌作為與人類生活緊密相關(guān)的益生菌，被公認為安全的食品級微生物(generally regarded as safe，GRAS)[13]。它不僅能抑制有害菌生長，也能促進營養(yǎng)物質(zhì)的合成，改善胃腸道功能，治療胃腸道疾病。本實驗選用乳酸乳球菌中nisin(乳鏈菌肽)調(diào)控表達系

6、統(tǒng)(nisin-controlledgene expression，NICE)[14]，它是乳酸菌中應(yīng)用最廣泛、可控性最強的表達系統(tǒng)。通過乳酸菌表達系統(tǒng)和SOE(gene splicing by overlap extension)人工合成目的抗菌肽基因獲得人源和雜合抗菌肽的蛋白分泌表達，研究其體外抗菌活性，同時體現(xiàn)益生菌和抗菌肽的協(xié)同作用，為后續(xù)動物及臨床實驗提供基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1、根據(jù)天然人源抗菌肽LL-37和H

7、D5的基因序列設(shè)計活性更好的雜合抗菌肽LLD1和LLD2。
　　2、體外拼裝合成四條抗菌肽LL-37、HD5、LLD1和LLD2，并構(gòu)建重組分泌型表達載體pNZ8148-sp-LL37/HD5/LLD1/LLD2，最終在乳酸乳球菌NZ9000中分泌表達。
　　方法：
　　1、選取抗菌肽LL-37與抗菌肽HD5作為雜合設(shè)計的藍本，在GenBank中找到此兩條抗菌肽的基因序列，根據(jù)乳酸乳球菌的偏愛密碼子從新優(yōu)化它們的基因序

8、列，以使其能在乳酸乳球菌中更好的表達。最終設(shè)計了兩條雜合抗菌肽LLD1和LLD2的基因序列，并通過生物信息學(xué)方法對此總共四條抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)、兩親性、等電點、跨膜區(qū)域等方面進行分析預(yù)測，從中比較它們之間的抗菌活性。
　　2、根據(jù)乳酸乳球菌表達偏愛密碼子的數(shù)據(jù)庫，得到優(yōu)化后的四條抗菌肽基因序列。分別將每條抗菌肽的基因全序列分為4段，設(shè)計成具有18-20bp的重疊引物，利用重疊延伸PCR方法擴增合成抗菌肽基因全序列，并在基因序列兩端引

9、入限制性內(nèi)切酶位點Kpn I和Xba I。最后將合成的四條抗菌肽基因分別與質(zhì)粒pMD19-T simple連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10中。得到陽性克隆子后，提取質(zhì)粒，用雙酶切鑒定法和基因測序進行驗證。
　　3、將驗證正確的四種抗菌肽重組子進行雙酶切，切膠回收抗菌肽基因序列片段，與分泌型表達載體pNZ8148-sp質(zhì)粒連接，電轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌NZ9000中，構(gòu)建四種重組乳酸菌。通過菌液PCR法、雙酶切法和基

10、因測序鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。挑取驗證正確的重組乳酸菌進行培養(yǎng)，經(jīng)過nisin誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，四種抗菌肽分別得到分泌表達，通過Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳、Western Blot和DotBlot鑒定表達產(chǎn)物。利用截留分子量為30KD和1KD的超濾離心管分步進行超濾離心濃縮上清表達產(chǎn)物，得到較為純化的上清液進行抑菌活性實驗。實驗結(jié)果
　　1、我們通過乳酸乳球菌的偏愛密碼子，重新設(shè)計抗菌肽LL-37和HD5的基因序列，并以此為母本

11、，雜合設(shè)計出兩條新的抗菌肽LLD1和LLD2。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，抗菌肽LLD1、LLD2、HD5、LL-37都屬于α-螺旋結(jié)構(gòu)為主的陽離子型抗菌肽，它們的C-端都具有兩親性。兩親性表現(xiàn)明顯的抗菌肽LLD2，它的C端疏水性最強。四條抗菌肽均沒有沒有明顯的跨膜螺旋區(qū)域，意味著它們也許并不是傳統(tǒng)意義的跨膜蛋白，其作用機制可能與通過靜電引力與細胞膜相結(jié)合，進而形成穿膜孔洞相關(guān)。經(jīng)過一系列分析后，整體來講，經(jīng)過雜合的抗菌肽LLD2可能比其它三條

12、抗菌肽的抗菌活性更強。
　　2、利用設(shè)計合成好的互補引物，通過重疊延伸PCR成功合成目的抗菌肽基因的全長序列。本實驗合成抗菌肽LLD1基因全長為100bp，LLD2基因全長為112bp，HD5基因全長為115bp，LL37基因全長為130bp，經(jīng)電泳結(jié)果分析，與預(yù)期擴增片段大小一致。經(jīng)過雙酶切鑒定和基因測序均顯示驗證正確。表明已成功克隆LLD1、LLD2、HD5和LL37四條目的片段，將該重組質(zhì)粒分別命名為pMD19Ts-LLD1

13、、pMD19Ts-LLD2、pMD19Ts-HD5和pMD19Ts-LL37。
　　3、經(jīng)過菌液PCR驗證，四條目的載體pNZ8148-sp-LLD1/LLD2/HD5/LL37的預(yù)計合成片段大小分別為400bp，412bp，415bp和430bp。在相對應(yīng)的泳道位置上均可見單一的明亮條帶，并大小一致，說明重組乳酸菌轉(zhuǎn)化成功。根據(jù)雙酶切和基因測序鑒定結(jié)果，表明重組分泌表達抗菌肽的乳酸乳球菌構(gòu)建成功。最終得到4種重組乳酸乳球菌，分別

14、命名為NZ9000-SLLD1，NZ9000-SLLD2，NZ9000-SHD5和NZ9000-SLL37。對四種重組乳酸菌的發(fā)酵上清液分別進行Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳檢測，在3.5-5KDa位置之間均可看到明亮的條帶，與預(yù)計的抗菌肽蛋白大小一致。并經(jīng)過免疫檢測，確認四種抗菌肽蛋白均得到正確分泌表達。上清表達產(chǎn)物經(jīng)過純化濃縮后進行抑菌實驗檢測，可看到四種抗菌肽均有表現(xiàn)出抑菌效果。并應(yīng)用不同體積的發(fā)酵上清進行獨立的抑菌試驗

15、，發(fā)現(xiàn)當(dāng)上清達到10mL時，大腸桿菌會被基本抑制生長。但在牛津杯抑菌實驗過程中，抑菌的重現(xiàn)性欠佳，由于選用的人源抗菌肽本身對益生菌無明顯抑菌作用，因此主要考慮為誘導(dǎo)過程中抗菌肽受到宿主細胞中蛋白酶的影響及純化條件不足導(dǎo)致蛋白純度和濃度不夠?？蛇M一步完善樣品純化工藝，確保檢測樣品的穩(wěn)定性。
　　結(jié)論：
　　1、為得到抗菌活性更強的抗菌肽以及能更易獲取抗菌肽和讓其更好的針對人體腸道疾病的治療，本實驗針對如何提高抗菌肽活性進行了雜

16、合設(shè)計和一系列的生物信息學(xué)研究，并且利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組益生菌另其得以源源不斷表達目的抗菌肽。
　　2、本實驗以抗菌肽HD5和LL37為藍本進行雜合，設(shè)計了雜合抗菌肽LLD1和LLD2。利用生物信息學(xué)軟件對四條抗菌肽序列進行等電點、兩親性、二級結(jié)構(gòu)以及跨膜結(jié)構(gòu)等預(yù)測分析，可以發(fā)現(xiàn)，抗菌肽LLD1、LLD2、HD5和LL37的等電點都大于7，它們的結(jié)構(gòu)都是以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主。而且，經(jīng)過雜合后的兩條抗菌肽，尤其是抗菌肽LLD2，具

17、有較母肽HD5和LL37更好的抑菌活性。
　　3、本實驗利用重疊延生PCR法合成四條抗菌肽基因LLD1、LLD2、HD5和LL37，并在pMD19-T simple載體中成功克隆，得到正確的抗菌肽基因序列。
　　4、本實驗成功構(gòu)建重組分泌型表達載體pNZ8148-sp-LLD1/LLD2/HD5/LL37，最終轉(zhuǎn)化到益生菌乳酸乳球菌NZ9000中，成功構(gòu)建了4種轉(zhuǎn)化基因工程菌NZ9000-SLLD1，NZ9000-SLLD2

18、，NZ9000-SHD5和NZ9000-SLL37，并成功進行了誘導(dǎo)表達。將含抗菌肽的發(fā)酵上清進行抑菌實驗，可見四種抗菌肽均有表現(xiàn)出抑菌效果。但由于樣品純化工藝存在不足，抗菌肽的純度和濃度欠佳，抑菌效果并不是十分穩(wěn)定。
　　5、在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，在以下方面還有待進一步研究和提高:(1)提高抗菌肽的表達量和穩(wěn)定性。(2)進一步進行動物實驗，驗證其在腸道菌群中的調(diào)節(jié)作用和對腸道免疫屏障的防御作用。(3)進一步改善抗菌肽基因的設(shè)計，研