紅掌遺傳轉化體系與抗菌肽基因表達載體的構建.pdf

1、紅掌（Anthurium andraeanum）為天南星科花燭屬多年生草本花卉，因其花葉形態(tài)奇特，花期持久，常作為切花材料；盆栽品種株型優(yōu)美，是廣泛應用于室內(nèi)裝飾的花卉。但是，紅掌在栽培生產(chǎn)過程中，極易受到細菌性葉斑病的侵害，嚴重時造成毀滅性損失，這是國內(nèi)外紅掌生產(chǎn)上的一大障礙。因此，開展抗病基因工程研究、培育抗病品種具有重要理論意義及應用價值。
　　本研究在前人研究的基礎上，就紅掌的再生體系、農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化體系、抗菌肽基因

2、及其修飾、融合基因及植物表達載體、農(nóng)桿菌轉化等方面進行了研究，取得了以下實驗結果。
　　1、優(yōu)化了紅掌的再生體系。以盆栽紅掌品種SYN-A的愈傷組織為供試材料，以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，探討了不同生長素（2,4-D、NAA、IBA）、不同細胞分裂素（6-BA、TDZ）及其濃度配比對紅掌愈傷組織不定芽分化的影響。在本試驗條件下，紅掌愈傷組織的不定芽分化率都達到了76.67％以上，其中最優(yōu)培養(yǎng)基組合為1/2MS+6-BA0.5

3、mg/L+2,4-D0.1 mg/L，愈傷組織的不定芽分化率可達100%，再分化系數(shù)高達31.06，且不定芽生長良好。
　　2、探明了紅掌對三種抗生素的敏感性差異。試驗結果表明，紅掌外植體對潮霉素的敏感性高于卡那霉素，前者更適用于紅掌轉基因組織的篩選，其使用濃度以20 mg/L為宜；其次，紅掌外植體對頭孢霉素的敏感度較低，在添加濃度為600 mg/L、培養(yǎng)8周時，外植體依然能正常生長，試驗時使用濃度500 mg/L即可達到良好的抑

4、菌效果。
　　3、初步建立了農(nóng)桿菌介導的紅掌遺傳轉化體系。以紅掌愈傷組織為受體材料，以農(nóng)桿菌EHA105為供試菌種，通過正交試驗方法，探討了外植體預培養(yǎng)時間、農(nóng)桿菌侵染時間、超聲波處理時間和共培養(yǎng)時間等對遺傳轉化的影響，其影響程度依次為共培養(yǎng)時間>預培養(yǎng)時間>侵染時間>超聲時間。初步建立了適用于紅掌的遺傳轉化體系：切取1 cm×1 cm×0.5 cm大小的愈傷組織塊、預培養(yǎng)3 d，以OD600值為0.6的菌液、侵染時間20 min

5、，侵染期間超聲波處理20 s，無需共培養(yǎng)，而后經(jīng)抑菌培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)，可獲得抗性愈傷組織。
　　4、構建了含抗菌肽融合基因的植物表達載體及工程農(nóng)桿菌。應用生物信息學方法，以病程相關蛋白PR1a的信號肽與抗菌肽Shiva-1為基本序列，利用紅掌偏愛密碼子進行修飾優(yōu)化后，合成了含特異酶切位點的抗菌肽融合基因（命名為AaAMP），并連接入中間載體 pCAMBIA1301，成功構建了植物表達載體 pCAMBIA1301-AaAMP，進而轉化