海洋紅酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化體系的研究.pdf

1、海洋紅酵母Rhodotorulabenthica富含氨基酸、維生素和以蝦青素為主的類胡蘿卜素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，尤其重要的是能與魚蝦貝共生，一般不致病，且具有耐鹽性能在高鹽條件下生長良好。海洋紅酵母在醫(yī)藥、食品、化工和農(nóng)業(yè)等方面得到了越來越廣泛的重視。如果能通過基因工程手段構(gòu)建一種可以表達(dá)和分泌外源基因產(chǎn)物的海洋紅酵母工程菌，該外源基因產(chǎn)物是能抑殺病原菌微生物的抗菌肽、乳菌肽和溶菌酶等，從而把海洋紅酵母作為一種益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，減少抗生

2、素等藥物的使用。這對于解決當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖面臨的藥物殘留超標(biāo)等安全質(zhì)量問題具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 抗菌肽具有廣譜的抗細(xì)菌活性，同時還具有高效的抗真菌、抗病毒和抗腫瘤活性：而且由于其不易產(chǎn)生耐藥性和作用對象選擇性，抗菌肽是一種未來可望代替抗生素的安全藥物。抗菌肽在轉(zhuǎn)基因植物、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、人類及動物健康、疾病防治等方面已經(jīng)體現(xiàn)了其重要的應(yīng)用前景。 本研究采用PCR技術(shù)從海洋紅酵母中克隆應(yīng)用于表達(dá)載體構(gòu)建的元件，26SrDNA同源重

3、組序列，并進(jìn)行測序分析，確定其酶切圖譜后定向克隆到載體pTEF1/Zeo中，得到重組載體pTEF1/Zeo-2rDNA。 根據(jù)genebank公布的紅酵母Rhodotorula的偏愛密碼子設(shè)計α-Factor信號肽基因和抗菌肽CMIV基因，并人工合成這兩段基因的序列，得到393bp的SA序列，測序后，將其按正確的閱讀框架定向克隆在重組載體pTEF1/Zeo-2rDNA的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建成海洋紅酵母分泌型表達(dá)載體pTEF1/Ze

4、o-2rDNA-SA。 表達(dá)載體pTEF1/Zeo-2rDNA-SA經(jīng)過ApaI/NarI酶切線性化處理后，電擊轉(zhuǎn)化海洋紅酵母感受態(tài)細(xì)胞，通過Zeocin抗生素篩選、PCR鑒定陽性克隆。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果正確，表明外源DNA已成功地整合到海洋紅酵母基因組中。 本實(shí)驗還通過一系列的參數(shù)調(diào)整，優(yōu)化了載體pTEF1/Zeo-2rDNA-SA對海洋紅酵母的電轉(zhuǎn)化條件：當(dāng)采用對數(shù)生長中期(OD600值為1.2-1.4)的菌體制備感