線性基因表達(dá)框直接轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化和瞬時(shí)表達(dá).pdf

1、線性DNA直接轉(zhuǎn)化方法因其易操作、轉(zhuǎn)化效率高而且轉(zhuǎn)化受體不受限制等諸多優(yōu)勢(shì)在植物基因轉(zhuǎn)化中已被廣泛使用，所轉(zhuǎn)化外源基因能夠整合、表達(dá)并且穩(wěn)定遺傳給后代。線性DNA直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)主要用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，而在轉(zhuǎn)化過程中，卻存在著轉(zhuǎn)化動(dòng)力不足的問題。為了提高轉(zhuǎn)化效率，本研究以報(bào)告基因smGFP和GUS的線性DNA片段為轉(zhuǎn)化表達(dá)框，研究不同物理化學(xué)因素包括表面活性劑、滲透處理、鈣等處理對(duì)線性DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)框進(jìn)入細(xì)胞核及其在細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)效率的影響，以期

2、建立一種以線性DNA片段為轉(zhuǎn)化表達(dá)框、低成本高效率的瞬時(shí)表達(dá)直接轉(zhuǎn)化體系，并進(jìn)一步用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系。 ⑴通過構(gòu)建植物smGFP和GUS基因雙元表達(dá)載體，以洋蔥下表皮為實(shí)驗(yàn)材料，借助農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，研究不同濃度的CaCl2、6-BA、2,4-D、SilwetL-77、DowCorningQ2-5211和滲透處理對(duì)瞬時(shí)表達(dá)效率的影響。SmGFP和GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明各種物理化學(xué)因素在不同程度上促進(jìn)了農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)，且各因

3、素的最佳處理濃度依次為CaCl2，0.5mol/L；6-BA，0.2mg/L；2,4-D，0.2mgg/L；SilwetL-77，0.1‰；DowCorningQ2-5211，0.1‰。通過熒光表達(dá)強(qiáng)度和GUS染色分析發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌高滲處理能較好的提高轉(zhuǎn)化效率，0.1‰的DowCorningQ2-5211和SilwetL-77誘導(dǎo)也能提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率，但效果較滲透稍差。 ⑵將農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)篩選出的各種物理化學(xué)因素的最佳濃度用

4、于線性基因表達(dá)框的轉(zhuǎn)化。以洋蔥下表皮為轉(zhuǎn)化材料，對(duì)不同處理的線性smGFP和GUS基因表達(dá)框的瞬時(shí)表達(dá)分時(shí)段檢測(cè)；同時(shí)檢測(cè)FITC和SYBRGreenI標(biāo)記的GUS線性基因表達(dá)框轉(zhuǎn)化后在細(xì)胞中的定位和熒光強(qiáng)度，并利用流式細(xì)胞儀對(duì)熒光標(biāo)記基因進(jìn)入細(xì)胞核的效率進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，洋蔥組織塊經(jīng)過高滲處理15～20min后，再在smGFP/GUS線性表達(dá)框終濃度為100ng/mL的MS液體培養(yǎng)基中懸浮共培養(yǎng)1.5～2h即能有效的將smGFP

5、/GUS線性基因表達(dá)框轉(zhuǎn)化入細(xì)胞核內(nèi)，并在轉(zhuǎn)換后36h左右得到高效的瞬時(shí)表達(dá)，能快速建立瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。通過熒光標(biāo)記基因的定位和定量分析，高滲處理是促進(jìn)線性表達(dá)框直接轉(zhuǎn)化的最佳方法。 ⑶借助洋蔥下表皮中優(yōu)化的瞬時(shí)表達(dá)體系，將smGFP基因的線性片段轉(zhuǎn)化煙草葉片誘導(dǎo)的愈傷組織。煙草愈傷組織轉(zhuǎn)化后與對(duì)照相比有很強(qiáng)的熒光差異。通過高滲轉(zhuǎn)化法處理的轉(zhuǎn)化組愈傷熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，且生長(zhǎng)狀態(tài)幾乎不受影響，成活率高。通過對(duì)轉(zhuǎn)化T0代植株的PCR，RT