紅豆杉細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株ORCA3、MET1-RNAi基因表達(dá)分析.pdf

1、紅豆杉細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)是最有前景的解決紫杉醇藥源途徑之一。紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)過程中紫杉醇含量低而且極不穩(wěn)定在一定程度上限制其工業(yè)化生產(chǎn)。隨著紫杉醇生物合成途徑的闡明和關(guān)鍵酶及轉(zhuǎn)錄因子的克隆，使得通過利用基因工程方法構(gòu)建高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株成為可能。目前紅豆杉細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究相對較少，本文對根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅豆杉細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并獲得了系列轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞株。主要結(jié)果如下：
　　 1）植物表達(dá)載體構(gòu)建。首先從長春花和擬南芥中分

2、別克隆到ORCA3和DNA甲級轉(zhuǎn)移酶MET1基因，然后分別構(gòu)建了ORCA3 植物表達(dá)載體和MET1-RNAi 干涉載體，并轉(zhuǎn)化到土壤農(nóng)桿菌EHA105菌株中。
　　 2）對根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅豆杉細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化。
　　 對影響紅豆杉細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素,如菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)溫度和時間等進(jìn)行了優(yōu)化，得到最優(yōu)的轉(zhuǎn)化條件是：選用農(nóng)桿菌菌株EHA105、以生長狀態(tài)良好的曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為受體材料、菌液光

3、密度OD600=0.6、侵染時間25min、共培養(yǎng)最適溫度21℃、共培養(yǎng)時間為48 h；最適的頭孢霉素抑菌濃度、潮霉素篩選濃度分別為300 mg/L和8 mg/L。最優(yōu)的除菌及篩選方式為：用含100mg/L 頭孢霉素的無菌水沖洗10 s 共培養(yǎng)結(jié)束的細(xì)胞材料，然后將材料轉(zhuǎn)至含300mg/L 頭孢霉素的抑菌培養(yǎng)基上，兩周后轉(zhuǎn)至含150 mg/L 卡那霉素或8 mg/L 潮霉素的篩選培養(yǎng)基上,篩選3個周期可獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。
　　

4、3）轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株ORCA3基因表達(dá)分析。對篩選出的陽性細(xì)胞進(jìn)行GUS組織化學(xué)活性染色、外源基因的PCR擴增檢測和western blot分析，結(jié)果表明，外源目的基因已經(jīng)成功整合到紅豆杉基因組中，并在蛋白質(zhì)水平得到表達(dá)；用HPLC 法檢測紫杉醇含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株紫杉醇含量變化趨勢并不相同，這可能是由插入位點的不同導(dǎo)致的。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株紫杉醇的最高含量為159.3 μg/g 干重，為對照組的2.5倍。
　　 4）轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株MET