菊花轉(zhuǎn)基因體系的優(yōu)化與瞬時轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.），原產(chǎn)中國，是中國十大名花之一，同時它也是世界四大切花之首，占全球切花數(shù)量的30％。菊花腦（Chrysanthemumnankingense）為栽培菊花起源中參與起源且遺傳背景最為簡單的二倍體菊屬野生植物。在對栽培菊花進行分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分析時，其簡單的遺傳背景為解決因菊花較高染色體數(shù)而遇到的難題提供了極好的模式作用。轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為進行作物品種改良和基因功能研究

2、的重要手段。菊花是基因工程起步較晚的觀賞植物，轉(zhuǎn)化過程受載體和啟動子類型等的影響，成功轉(zhuǎn)化并能穩(wěn)定表達的研究報道較少。菊花遺傳轉(zhuǎn)化效率低及轉(zhuǎn)化的基因并沒有得到預(yù)期表達是菊花基因工程研究中亟待解決的問題之一。研究轉(zhuǎn)化方法和啟動子對菊花轉(zhuǎn)基因的影響有利于解決這一問題。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.35S:GUS、2×35S:GUS超表達菊花的獲得及表達分析
　　通過設(shè)計引物，利用PCR等技術(shù)從pCAMBIA1301 V

3、ector中克隆了35S啟動子、2×35S啟動子的序列。將35S啟動子和2×35S啟動子序列分別插入pORE R1 Vector、pORE R2 Vector中，分別獲得了重組載體pORE R1-35S:GUS、pORE R2-35S:GUS、pORE R1-2×35S:GUS、pORE R2-2×35S:GUS，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建的菊花遺傳轉(zhuǎn)化載體分別導(dǎo)入切花菊品種‘神馬’中。共轉(zhuǎn)化4090個菊花葉盤，經(jīng)過篩選共得到22個高表達轉(zhuǎn)

4、基因株系。22個轉(zhuǎn)基因株系經(jīng)PCR驗證發(fā)現(xiàn)目標片段已經(jīng)成功插入菊花基因組。GUS熒光定量PCR顯示:在同一類型的載體中，2×35S比35S啟動子表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢性，可獲得高表達的轉(zhuǎn)基因株系，前者的GUS表達量約為后者的2倍，GUS化學(xué)染色也較深。
　　2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菊花葉片瞬時轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建
　　本研究以GUS作為報告基因，通過農(nóng)桿菌注射滲透法將含有GUS基因的表達載體pORE R1-2×35S:GUS轉(zhuǎn)入菊花腦、菊花‘神

5、馬’和‘優(yōu)香’葉片，探討了基因型、葉片位置等因素對基因瞬時表達效果的影響。結(jié)果表明:菊花品種‘優(yōu)香’的瞬時轉(zhuǎn)化率最高，為76.67％，表達效率也最佳;菊花腦的轉(zhuǎn)化率最低，為60.0％，表達效率較差，部分葉片枯死;瞬時轉(zhuǎn)化注射葉片選擇第4片全部展開葉為宜。為了便于其它基因的操作，把GUS基因重組到Gateway載體pMDC43（2×35S），進一步驗證了其在上述種源中的瞬時表達有效性。該體系的建立為在菊花葉片中基因功能的分析提供了有效手段