草莓轉基因再生體系的建立及早花基因PcFT的轉化.pdf

1、草莓(Fragaria×ananassaDuch)是世界上最重要的草本果樹之一，生長周期短，果實風味濃郁、香味獨特，是最好的城市圈經濟栽培的漿果。草莓花芽分化需低溫和短日照，在露地栽培條件下4月底5月初成熟，供應期較短；促成和半促成栽培條件下，雖然果實成熟期可擴大至11月底～次年5月，但其余季節(jié)里仍無果實供應。如何調控其花芽分化，在適宜的時間結果，擴大其市場供應期，提高經濟效益，是科研和生產中需要解決的一個重要課題。植物基因工程的發(fā)展和

2、應用為草莓育種開辟了一條新途徑。由于農桿菌介導的遺傳轉化主要依賴于受體材料的再生能力及農桿菌的轉化效率，因此，良好而高效的受體再生體系的建立是進行成功的基因轉化關鍵所在。本試驗以草莓品種‘紅頰’和‘豐香’為試材，以草莓葉片和花藥為外植體，研究了離體再生過程中基因型、外植體、激素配比、暗培養(yǎng)時間等對不定芽再生效率的影響，建立了草莓葉片高效離體再生體系。在此基礎上，對影響農桿菌轉化效率的主要因素進行篩選，建立了農桿菌介導的轉化體系，將早實枳

3、中分離獲得的早花基因PcFT導入草莓，獲得轉化植株。Km篩選、PCR檢測證明目的基因已經整合到草莓基因組中。 主要研究結果如下： 1.研究了草莓‘紅頰’花藥再生的影響因素 以花粉發(fā)育時期為單核靠邊期的草莓紅頰花藥，在培養(yǎng)基MS+1.0mg/LTDZ+0.4mg/LIBA上誘導效果最佳，綠苗分化率達到12.3％，單倍體誘導率為1.11％。 2.建立了草莓葉片離體再生體系 在不定芽誘導中以MS+1.5

4、mg/LTDZ+0.4mg/LIBA對草莓‘紅頰’葉片誘導效果最佳，適量暗培養(yǎng)有助于提高再生頻率，暗培養(yǎng)4周再生頻率可達為67.8％；以MS+1.0mg/LTDZ+0.6mg/LIBA，暗培養(yǎng)3周對豐香誘導效果最好，再生頻率可達78.7％。草莓‘紅頰’再生難度及價值比‘豐香’高，選擇草莓紅頰進行進一步遺傳轉化的研究。 3.構建了表達載體pBI121-FT。 4.建立了草莓遺傳轉化體系，并獲得一棵草莓品種‘紅頰’轉化植株。

5、 在根癌農桿菌介導的基因轉化中，確定了有效的Km選擇壓為10mg/L。通過抑菌實驗，確定了合適的抗菌素及其濃度，即400mg/LCef。 對影響農桿菌轉化效率的各種因素進行篩選，得到了一條最佳的轉化途徑：葉片在分化培養(yǎng)基上預培養(yǎng)時間為3天；農桿菌培養(yǎng)至對數生長期，用MS+TDZ1.5mg/L+IBA0.4mg/L液體培養(yǎng)基重新稀釋懸浮培養(yǎng)；調整菌液濃度為OD600=0.3-0.5；侵染葉盤組織約10分鐘；共培養(yǎng)3天；然后

6、，延遲2周篩選，即將外植體接到含有400mg/LCef的誘導培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，2周后再轉接到含有選擇壓10mg/LKm和400mg/LCef的誘導培養(yǎng)基上進行選擇培養(yǎng)。 5.轉基因植株PCR檢測 經10mg/LKm選擇壓初步篩選出10棵‘紅頰’轉化植株，以未轉化植株為陰性對照，質粒DNA為陽性對照，PcFT基因的兩端序列作為特異引物進行PCR擴增檢測。檢測結果表明：在這些植株中有1棵植株經PCR擴增出的特異條帶和陽性對照