小麥無標記轉基因體系建立和HMW--GS基因的轉化_314.pdf

1、高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)是小麥籽粒貯藏蛋白的重要成分，影響著面團彈性和加工品質。AS208為輪選987組織培養(yǎng)后代中鑒定出的無性系變異體，該材料缺失了1Bx20和1By20亞基，雖與對照輪選987相比其面包品質明顯變差，但在鑒定其他HMW-GS功能和培育優(yōu)質弱筋小麥等方面具有潛在應用價值。本研究擬在建立AS208、濟麥22和矮抗58等中國商業(yè)化推廣小麥品種（系）農桿菌轉化體系及無篩選標記轉基因植株獲得體系的基礎上，將相關HMW

2、-GS基因轉入AS208等小麥材料中。主要研究結果如下:
　　1、以科農199、新春9號、CB037、Fielder和AS208等小麥品種（系）幼胚為材料進行農桿菌轉化，建立了這些小麥品種（系）幼胚為外植體的穩(wěn)定轉化體系，并成功轉化了大面積推廣品種科農199、師欒02-1、石4185、川麥42和冀麥5265，轉化效率分別達到22.7％、9.9％、8.0％、8.3％和14.7％。對獲得的轉基因植株進行試紙條檢測，陽性植株率達到90％

3、以上。
　　2、通過培養(yǎng)基改良和愈傷組織生理狀態(tài)調整，建立了小麥成熟胚高效再生體系，利用農桿菌轉化Verry、 CB037成熟胚成功獲得了轉基因植株，轉化率分別為0.23％和0.61％。
　　3、利用農桿菌介導法將攜帶GUS和bar基因的雙T-DNA載體成功轉入了科農199、新春9號、CB037和Fielder等小麥品種（系），對轉基因植株T0代進行組織化學染色、試紙條、PCR和Southern blot檢測。結果發(fā)現(xiàn)，目標

4、基因和標記基因共轉化效率為49.0％左右。對T1代植株中的GUS和bar基因進行組織化學染色、試紙條、PCR和Southern blot檢測，獲得了只含有GUS基因而不含有bar基因的轉基因植株;通過統(tǒng)計T1代中不同基因組合的頻率，發(fā)現(xiàn)無篩選標記轉基因植株頻率為14.5％。結合Southern blot檢測結果，認為載體上2段T-DNA區(qū)的長度和比例影響了2個基因在小麥基因組上整合的拷貝數和表達水平，進而影響了目標基因和標記基因的分離。

5、
　　4、通過對T1代轉基因植株進行試紙條和PCR檢測，發(fā)現(xiàn)bar基因在T1代中普遍存在沉默現(xiàn)象，沉默率達33.5％;而T1代中對GUS基因進行的PCR檢測與組織化學染色結果一致，證明T1代中GUS基因沒有發(fā)生沉默。通過重亞硫酸鹽對bar基因測序分析，發(fā)現(xiàn)bar基因沉默由35S啟動區(qū)一些位點的甲基化引起。
　　5、利用農桿菌介導法分別將攜帶1By8、1Bx20、1By20和1Sx2.3等HMW-GS基因的雙T-DNA植物表達

6、載體轉入了AS208中，利用試紙條共檢測出69株轉基因植株，其中，轉1By8植株20株，轉1Bx20植株20株，轉1By20植株19株，轉1Sx2.3植株10株。同時，對獲得T0代轉基因植株中的Glu-1B基因進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)，含有1By8基因植株4株，含有1Bx20基因植株8株，含有1By20基因植株5株，含有1Sx2.3基因植株4株。進一步對從陽性植株籽粒中提取的HMW-GS進行SDS-PAGE分離鑒定，發(fā)現(xiàn)除1Sx2.3亞基在