農(nóng)杜菌介導無標記耐鹽基因水稻高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立.pdf

1、全世界鹽堿地面積約占世界總耕地面積的20％。由于干旱，不合理的灌溉以及化肥的過度使用，工業(yè)污染加劇，土壤鹽堿化正不斷擴大，可供耕種的土地面積正日趨減少。水稻是世界1/3人口的主食，但一直處于供不應求的狀況，因此，提高水稻產(chǎn)量，改良稻米品質(zhì)關系到人類的生存和發(fā)展。在鹽堿地區(qū)，利用轉(zhuǎn)基因手段來獲得高耐鹽的轉(zhuǎn)基因水稻，推廣具有廣泛適應性的水稻耐鹽優(yōu)異品種，是開辟鹽堿荒地和水稻增產(chǎn)的一個新增長點，目前運用最廣泛的轉(zhuǎn)基因水稻方法之一是農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)

2、化法。研究建立農(nóng)桿菌介導耐鹽基因高效水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)具有重要理論和實際指導意義。根據(jù)外源基因是耐鹽基因的特點，建立農(nóng)桿菌介導無選擇標記耐鹽基因水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對轉(zhuǎn)基因水稻商品化應用具有重大意義，避免了抗性標記基因可能存在對食品和生態(tài)環(huán)境的潛在危害。
　　 制約農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化水稻效率的主要因素是周期長和轉(zhuǎn)化受體的狀態(tài)。本文從這兩方面入手，建立高效農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化水稻系統(tǒng)。根據(jù)外源基因是耐鹽基因，探討NaCl作為篩選劑可行性，但傳統(tǒng)確定NaC

3、l篩選濃度需要繪制NaCl濃度梯度對愈傷組織增重率之間的生長曲線。此過程比較繁瑣且容易造成污染和誤差。探討利用NaCl對水稻種子發(fā)芽率的抑制效果作為確定水稻耐鹽基因轉(zhuǎn)化中愈傷組織篩選所需NaCl使用濃度的可行性，同時比較NaCl與潮霉素的篩選效果。最后，將兩者有機結(jié)合，對不同類型的耐鹽基因進行農(nóng)桿菌介導無標記高效轉(zhuǎn)化水稻，證明該系統(tǒng)是完全可行和有效的。主要實驗結(jié)果如下：
　　 (1)快速誘導水稻愈傷組織的建立
　　 在3

4、2℃暗培養(yǎng)7天誘導水稻愈傷組織的快速誘導系統(tǒng)，日本晴、秀水11、，春江06的出愈率均在60％以上，分別是92.87％、82.63％、64.83％;在28℃光培養(yǎng)7天誘導水稻愈傷組織的快速誘導系統(tǒng)，日本晴、秀水11、春江06的出愈率均在70％以上，分別是95.5％、93.07％、74.87％。愈傷表面突起，呈淡黃色，具有活力，完全符合轉(zhuǎn)化的要求，從傳統(tǒng)的愈傷組織誘導需要15天縮短到7天。
　　 (2)高效農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化水稻的建立<

5、br>　　 采取熱激處理，中華11、秀水11、春江06轉(zhuǎn)化效率提高率分別在58.50％、21.96％、27.85％;液體共培養(yǎng)感染，三種水稻轉(zhuǎn)化率提高有60.57％、23.54％、25.17％，建立高效農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化水稻。
　　 (3)簡便獲得NaCl有效篩選濃度法的建立
　　 根據(jù)常規(guī)的NaCl濃度梯度對愈傷組織增重率之間的生長曲線，確定愈傷組織增重抑制率為80％左右的NaCl濃度為合適的篩選濃度，此相應NaCl濃度

6、對四個品種水稻種子的發(fā)芽抑制率均達50％以上。因此，可選取對水稻種子的發(fā)芽抑制率達50％以上的NaCl濃度作為耐鹽基因轉(zhuǎn)化中篩選時NaCl有效濃度的重要參考。
　　 (4)證明轉(zhuǎn)化耐鹽基因中NaCl篩選的有效性和可行性
　　 根據(jù)選取的外源基因為耐鹽基因，以NaCl作為篩選劑，達到了篩選的目的，對中華11來說，NaCl篩選下轉(zhuǎn)化率為11.98％，潮霉素篩選下轉(zhuǎn)化率為14.43％;對秀水11來說，NaCl篩選下轉(zhuǎn)化率為32

7、.06％，潮霉素篩選下轉(zhuǎn)化率為42.64％;對春江06來說，NaCl篩選下轉(zhuǎn)化率為32.03％，潮霉素篩選下轉(zhuǎn)化率為41.39％，說明NaCl篩選效果與潮霉素篩選相近。
　　 (5)安全高效農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化水稻的建立
　　 采用NaCl篩選與高效農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化水稻相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)秀水11轉(zhuǎn)化效率提高率29.9％，建立安全高效農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化水稻。
　　 (6)證明安全高效農(nóng)桿菌介導耐鹽基因轉(zhuǎn)化日本晴的可行性和有效性

8、>　　 選取不同耐鹽機制的耐鹽基因，將其作為外源基因采用建立的農(nóng)桿菌介導無選擇標記耐鹽基因高效轉(zhuǎn)化水稻系統(tǒng)對日本晴進行轉(zhuǎn)化，實驗表明：BADH、CMO、PKCC的轉(zhuǎn)化效率均在40％以上，分別是44.03％、46.29％、44.68％，證明農(nóng)桿菌介導無標記耐鹽基因高效轉(zhuǎn)化日本晴是可行和有效的。
　　 綜上所述，安全，快速，高效的農(nóng)桿菌介導耐鹽基因轉(zhuǎn)化水稻系統(tǒng)已經(jīng)建立。即32℃光培養(yǎng)7天后，進行43℃水浴30min，冰浴1min，