苜蓿再生體系的建立與轉(zhuǎn)化體系的條件探索.pdf

1、苜蓿（Medicagosativa L.）為世界上分布最廣的一種牧草，享有“牧草之王”的美譽。因其秋眠性與生產(chǎn)性能和抗寒性相關(guān)，現(xiàn)成為各地選擇適宜品種的首要指標，但是目前苜蓿秋眠的機理卻不清楚，急需我們在苜蓿秋眠的研究上有所突破。
　　本研究首先建立苜蓿植株的再生體系，后通過對農(nóng)桿菌介導的苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的條件進行探索來試圖獲得phyA和phyB的RNA干擾植株，以研究phyA和phyB的基因功能及苜蓿秋眠的分子調(diào)控機理。主要

2、研究結(jié)果如下:
　　1、再生體系的建立。對于不同的品種和不同的外植體來說，其愈傷誘導能力各不相同。品種伏納爾和WL-525HQ，無論是子葉還是下胚軸，其誘導率均高于WL-343HQ和WL-232HQ;對于外植體來說，下胚軸的愈傷誘導率要極顯著高于子葉。2，4-D的合適濃度為2mg/L，高濃度的2，4-D容易引起褐化;對于不同的細胞分裂素來說，在2，4-D濃度為2mg/L的情況下，KT和6-BA都是隨著濃度的升高，其外植體的愈傷誘導

3、率在不斷的降低。故選擇出愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+2mg/L2，4-D+0.25mg/LKT+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉;適宜的分化培養(yǎng)基為MS+0.5mg/LKT+0.01mg/LNAA+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉，分化出苗情況最好。故綜合考慮秋眠級及再生情況將伏納爾品種的下胚軸作為最佳的轉(zhuǎn)化受體。
　　2、轉(zhuǎn)化體系條件的探索得到以下結(jié)果:農(nóng)桿菌菌液中目的片段phyA和phyB沒有丟失，可放心進行農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)

4、化;最佳的農(nóng)桿菌侵染時間為10min;合適的羧芐青霉素抑菌濃度為300mg/L;適合的卡那霉素選擇壓為50mg/L。故建立的轉(zhuǎn)化體系如下:預培養(yǎng)基為MS+2mg/L2，4-D+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉;共培養(yǎng)基同預培養(yǎng)基;選擇培養(yǎng)基為MS+2mg/L2，4-D+0.25mg/LKT+300mg/Lcarb+50mg/Lkan+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉;分化培養(yǎng)基為MS+0.5mg/LKT+0.01mg/LNAA+300mg/