莖瘤芥高效再生體系與遺傳轉(zhuǎn)化體系研究.pdf

1、藥用植物組織培養(yǎng)(medicinal plant tissue culture)不僅是基因工程應(yīng)用于植物資源開發(fā)與利用方面的重要技術(shù)基礎(chǔ)，而且在藥用植物的資源保護和可持續(xù)利用方面具有重要的作用。本文主要研究具有廣泛食用與藥用價值的十字花科蕓薹屬芥菜類植物莖瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)組織培養(yǎng)基的優(yōu)化，花期相關(guān)基因cry2的克隆分析、載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化體系建立。
　　組織培養(yǎng)基

2、的優(yōu)化:以莖瘤芥種子為實驗原材料，采用無菌組培法，種子在1/2MS培養(yǎng)基中生長6天后得到無菌苗，取其子葉作為外植體，應(yīng)用正交試驗法研究不同濃度生長激素6-BA、NAA、2.4-D對外植體分化，愈傷組織成苗率的影響。研究結(jié)果顯示最適合莖瘤芥外植體分化成苗的培養(yǎng)基為MS加6-BA3mg/L、NAA0.10mg/L、2.4-D0mg/L，其中1/2MS加0.10mg/L NAA適用于后期組培苗生根，優(yōu)選培養(yǎng)基的再生頻率具有較大的提高。

3、　　花期相關(guān)基因cry2的克隆與載體構(gòu)建:隱花色素cry2（cryptochrome2）是調(diào)控花期的重要基因，在植物體中控制花青素生長與調(diào)控營養(yǎng)均衡;介導(dǎo)子葉下胚軸生長與幼苗去黃化作用;維持內(nèi)源節(jié)律。本實驗根據(jù)莖瘤芥親緣性植物同源性比較，設(shè)計出cry2基因擴增引物，成功克隆莖瘤芥cry2基因，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建出此基因的超表達載體、RNAi載體，并成功轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌GV3101，獲得工程菌株。
　　遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立:以含cry2基因

4、RNAi載體的農(nóng)桿菌菌株GV3101為轉(zhuǎn)化材料，應(yīng)用正交試驗法研究莖瘤芥遺傳轉(zhuǎn)化過程中不同的預(yù)培養(yǎng)時間、共培養(yǎng)時間、侵染液濃度、侵染時間組合，Kan選擇壓對轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果顯示最適合莖瘤芥cry2基因RNAi載體遺傳轉(zhuǎn)化的條件為預(yù)培養(yǎng)2d、共培養(yǎng)4d、侵染液濃度0D600=0.5，侵染10min、Kan選擇壓為30mg/L。
　　通過對具有廣泛應(yīng)用價值的莖瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et