八仙花和金絲桃再生與遺傳轉(zhuǎn)化體系研究.pdf

1、八仙花[Hydrangea macrophylla(Thunb)Ser.]和艷果金絲桃(Hypericumandrosaemum L.)分別為繡球科和金絲桃科的木本觀賞植物。八仙花以花大色艷,花期長(zhǎng),成為庭園花境、林緣、基礎(chǔ)種植、大型花卉裝飾和盆花的極好材料；艷果金絲桃以果實(shí)美麗、果枝長(zhǎng)、冬季枝條常綠、掛果期長(zhǎng)成為冬季庭園花灌木的新型花灌木,也是最近幾年來國(guó)內(nèi)外新型的插花配材。它們?cè)谠耘喙芾碇卸既菀壮霈F(xiàn)病害問題,如八仙花的葉斑病和金絲桃

2、的根結(jié)線蟲病?；蚬こ淌翘岣咚鼈兛共⌒缘挠行緩街?。本文通過對(duì)外植體、培養(yǎng)條件、接種方式、激素種類、不同基因型等條件的比較試驗(yàn),建立了八仙花和金絲桃穩(wěn)定高效的再生體系,并對(duì)以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了研究。另外,對(duì)八仙花葉斑病進(jìn)行了分離和分子鑒定。其主要研究結(jié)果如下:
　　 1.建立并完善了高效穩(wěn)定的八仙花快繁與再生體系獲得了完全脫毒的八仙花Hyd1、Hyd4和Hyd5三個(gè)基因型的無菌苗。以這三個(gè)基因型帶芽莖段為外植體

3、,對(duì)其組培快繁技術(shù)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:三個(gè)基因型莖段均在B5+0.5 mg/L BA+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基上增殖效果最好,平均增殖芽數(shù)均達(dá)到了3個(gè)以上。其中以基因型Hyd1為例,獲得的最佳生根培養(yǎng)基為60 mL珍珠巖+30 mL液體培養(yǎng)基(1/2 B5+0.5 mg/L IBA),30d后生根率和移栽成活率達(dá)到100％。
　　 以八仙花七個(gè)基因型Hyd1、Hyd4、Hyd5、Hyd6、Hyd7、Hyd8和Hyd10的

4、葉片和葉柄為外植體,通過培養(yǎng)基、激素和暗培養(yǎng)等因子比較試驗(yàn)得出,以葉片為外植體獲得的最佳再生培養(yǎng)基為B5+2.25 mg/L BA+0.1 mg/L IBA+100 mg/L頭孢霉素(Cef),暗培養(yǎng)20d后轉(zhuǎn)入光照下培養(yǎng),再生頻率和平均再生芽數(shù)分別為100％和2.7個(gè)。不同基因型的再生能力差異較大,除基因型Hyd1外,其他六個(gè)基因型葉片的再生頻率均低于30％。
　　 通過ISSR分子標(biāo)記對(duì)直接再生苗進(jìn)行的體細(xì)胞變異檢測(cè)中,共得

5、到1857個(gè)條帶,相似度在0.980-0.983之間。表明直接再生苗不存在明顯的體細(xì)胞變異。
　　 2.初步建立了八仙花基因型Hyd1的遺傳轉(zhuǎn)化體系以再生率高的基因型Hyd1葉片為試驗(yàn)材料,通過抗生素、預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌菌株等因素對(duì)比試驗(yàn),探討了相關(guān)因子對(duì)八仙花遺傳轉(zhuǎn)化的影響。研究表明:葉片不定芽再生的篩選濃度為20 mg/L卡那霉素(Km),再生苗生根的篩選濃度為200mg/L Km,200 mg/L Cef作為

6、抑菌劑。葉片在預(yù)培養(yǎng)0d,侵染35 min和共培養(yǎng)3d條件下,GUS瞬間表達(dá)率最高可達(dá)100％。該轉(zhuǎn)化條件結(jié)合延遲篩選7d可獲得100％抗性愈傷率和12個(gè)抗性芽?？剐杂鷤M織在后期分化抗性芽較為困難,需要進(jìn)一步研究其分化條件。
　　 3.建立了高效穩(wěn)定的艷果金絲桃快繁與再生體系以MS基本培養(yǎng)基和BA/NAA配比對(duì)比試驗(yàn)表明,以基因型Hyp3帶腋芽莖段為外植體在MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L的培養(yǎng)基上獲得了最優(yōu)的腋

7、芽誘導(dǎo)及增殖效果,叢生芽誘導(dǎo)率和平均增殖芽數(shù)分別為100％和3.7個(gè)。
　　 以艷果金絲桃四個(gè)基因型Hyp1、Hyp3、Hyp4和Hyp7葉片為外植體對(duì)其再生體系進(jìn)行的研究表明,MS+TDZ0.1 mg/L+AgNO31.0 mg/L+蔗糖30mg/L為最優(yōu)的再生培養(yǎng)基,在暗培養(yǎng)20d后轉(zhuǎn)入光周期下培養(yǎng),再生率達(dá)83.3％。不同基因型葉片再生效果差異較大,其中,以基因型Hyp3的再生能力最強(qiáng)。
　　 4.初步建立了艷果金

8、絲桃遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)影響艷果金絲桃基因型Hyp3遺傳轉(zhuǎn)化預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間等的幾個(gè)因子進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:Hyp3葉片為外植體以EHA105為侵染菌株,預(yù)培養(yǎng)0d,侵染5min,在MS+TDZ0.1 mg/L+NAA0.01 mg/L+AS40 mg/L+MES2.0g/L培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d,然后轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基(MS+TDZ0.1 mg/L+NAA.0.01 mg/L+AgNO31.0 mg/L+cef200 mg/L)上培養(yǎng)。在該