中國水仙遺傳轉(zhuǎn)化體系研究及NTLEAFY基因在花芽分化過程中的表達(dá).pdf

1、中國水仙（Narcissus tazettavar．chinensis）是我國十大傳統(tǒng)名花之一，栽植歷史悠久。但由于其為三倍體植株，不結(jié)實(shí)，傳統(tǒng)的雜交育種無法進(jìn)行，千年來只有‘金盞銀臺(tái)’，‘玉玲瓏’等少數(shù)幾個(gè)品種，限制了中國水仙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。隨著生物技術(shù)的不斷成熟，特別是基因工程技術(shù)的發(fā)展為中國水仙的品種創(chuàng)新提供了有效途徑。建立有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系、發(fā)掘中國水仙中潛在的基因資源是中國水仙基因工程育種的必要前提。
　　通過對中國水仙‘金

2、盞銀臺(tái)’品種的各花器官愈傷組織的誘導(dǎo)，篩選出花梗為最佳外植體。其優(yōu)點(diǎn)有：滅菌方法簡便；無愈傷組織誘導(dǎo)、繼代難的問題；鱗莖芽再生時(shí)間短。篩選出花梗愈傷組織誘導(dǎo)及鱗莖芽分化的最佳培養(yǎng)基為MS+1 g·L-1NaH2PO4+0.003g·L-16-BA+0.001g·L-1NAA+0.2g·L-1Ad+30 g·L-1sucrose。愈傷誘導(dǎo)率達(dá)43.33％，愈傷組織誘導(dǎo)到鱗莖芽分化的時(shí)間一共需要30～35 d，比其它組織通過愈傷組織途徑誘導(dǎo)

3、芽再生時(shí)間縮短約50 d。組織學(xué)觀察表明小鱗莖是由愈傷組織再分化得來的。
　　通過對幾種不同農(nóng)桿菌菌株侵染率的比較，選擇菌株LBA4404；侵染時(shí)100 mg·L-1的乙酰丁香酮對農(nóng)桿菌具有較好的活化作用；最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為15 d；最佳共培養(yǎng)時(shí)間為3 d；最佳抑菌抗生素為頭孢霉素，濃度控制在400 mg·L-1。GUS染色結(jié)果顯示農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化花梗外植體得到了陽性的鱗莖芽。利用該方法進(jìn)行NTLEAFY基因的轉(zhuǎn)化，PCR檢

4、測及Southern雜交檢測證明得到轉(zhuǎn)NTLEAFY基因已經(jīng)整合到中國水仙基因組中。
　　LEAFY基因是成花相關(guān)基因，與中國水仙的花芽分化相關(guān)。切片觀察表明從7月上旬開始，經(jīng)葉芽時(shí)期、花序原基形成期、佛焰狀總苞形成期、花原基形成期、花被片形成期、雄蕊形成期、雌蕊形成期7個(gè)時(shí)期，到9月中旬形成雌蕊結(jié)束。分別取中國水仙花芽分化各階段的組織，用qRT-PCR方法進(jìn)行NTLEAFY的表達(dá)模式分析，主花序中表達(dá)量在花芽分化中、后期比花芽分