菊花‘神馬’花芽分化期的數(shù)字基因表達譜及關鍵基因的克隆和表達分析.pdf

1、菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）是菊科(Asteraceae)菊屬(Chrysanthemum)植物，是世界四大鮮切花之一。栽培品種3000多個，用于切花菊的品種多為典型的短日照植物，光周期途徑調(diào)控開花主要由光受體基因接受光信號，傳遞給節(jié)律鐘基因，通過節(jié)律鐘調(diào)控輸出基因激活下游轉(zhuǎn)錄因子的表達，在葉中上調(diào)促進開花基因的表達，輸送到莖尖與成花整合因子作用完成花芽分化。
　　 本研究以白色切花菊‘

2、神馬’為試材，因其典型的短日照特點，能較準確人工調(diào)控花芽分化進程，是研究菊花花芽分化分子機理的模式材料。通過大規(guī)模高通量測序，獲得數(shù)據(jù)與NCBI核酸蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，經(jīng)生物信息分析，確定功能分類及涉及的代謝途徑，獲得菊花花芽分化期相關的基因表達信息，探索在菊花不同花芽分化階段相關基因的差異表達富集模式及表達譜;對光周期途徑的關鍵基因進行全長的克隆與表達分析，在分子水平上對菊花開花時間的網(wǎng)絡途徑有初步的了解，為后期進一步進行基因的功能驗

3、證及通過分子育種方法（反義抑制或轉(zhuǎn)基因）培育目標花期新品種提供基礎理論依據(jù)。
　　 本研究主要成果如下:
　　 1.本試驗獲得菊花花芽分化期轉(zhuǎn)錄組ESTs，對所有unigenes進行功能分類，收集到54，488條分屬于分子功能、細胞組分和生物學過程的unigenes。其中參與分子功能的共12種，參與細胞組分的共11種，參與生物學過程的共18種。得到編碼蛋白框(CDS)的核酸序列和氨基酸序列為54，644條。用ESTsca

4、n比對所有unigenes，得到其CDS的核酸序列和氨基酸序列均為8，506條。將所有unigenes與COG數(shù)據(jù)庫BLAST比對顯示，共獲得22，871條與已知其他植物同源，屬于23類直系同源簇群，未知功能的有780條;得到25，001條參與代謝通路的unigenes，從中收集到與植物節(jié)律代謝通路相關unigenes共269條，從中比對到參與光周期途徑的光受體基因、生物節(jié)律鐘基因和生物節(jié)律鐘輸入和輸出基因等相似功能基因共20個。

5、>　　 2.初步得出菊花花芽分化期涉及植物節(jié)律途徑的數(shù)字基因表達譜:
　　 菊花光受體HYB在花芽分化啟動期表達量達最高值，是暗處理前的近五倍，隨后稍有下降，到總苞鱗片分化中期仍維持暗處理前的近三倍，到分化完成一直還維持近兩倍的表達量;
　　 節(jié)律鐘組件APRS、TOC1表達高峰值均出現(xiàn)在總苞鱗片分化中期;PIF3高峰值出現(xiàn)在花芽分化啟動期，到總苞鱗片分化中期仍維持暗處理前的近三倍;FKF1在花芽分化啟動期上調(diào)到高峰值

6、，總苞鱗片分化中期下調(diào)表達，隨后在小花原基分化中期和分化完成期又上調(diào)到高峰。
　　 節(jié)律鐘輸出基因GI在花芽分化啟動期表達量達最高值，在總苞鱗片分化中期稍有下降，分化完成期又有回升。
　　 CO暗處理一天后反而表達量降低，在總苞鱗片分化中期表達量達最高值。
　　 CHS（查爾酮合成酶）在暗處理一天后表達量上調(diào)，啟動期達近五倍的最高值，總苞鱗片分化中期表達量稍下降，隨后在小花原基分化中期下調(diào)表達。
　　 3

7、.初步得出菊花花芽分化期差異表達基因顯著富集的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑:集中在光合作用及核蛋白體途徑中。
　　 4.初步得出菊花不同花芽分化階段差異表達基因富集參與的生物功能:
　　 花芽未分化期，植物中蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族基因和蛋白參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、氧化還原酶活性基因轉(zhuǎn)錄加強;花芽分化啟動期，脂肪酸合成酶、糖氫共轉(zhuǎn)運蛋白活性基因差異表達富集，蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的差異表達顯著;總苞鱗片分化中期，信息顯示

8、富集在各種蛋白質(zhì)、核苷酸糖的合成;小花原基分化中期，蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性加強，氧化還原酶活性基因轉(zhuǎn)錄加強;花冠分化末期即花芽分化完成期，基因差異表達富集仍在結(jié)構(gòu)分子活動、砷酸鹽還原酶活性和作為花和花粉發(fā)育的能量來源的脯氨酸的累積等方面。
　　 5.從菊花‘神馬’中克隆得到節(jié)律鐘輸出基因GIGANTEA的cDNA全長序列，命名為CmGI基因，登錄號為JQ043439。對其做序列信息分析;菊花CmGI的表達呈晝夜節(jié)律表達模式，

9、高峰值出現(xiàn)在16:00;不同花芽分化階段葉片中CmGI基因mRNA水平差異大，兩個高峰值分別出現(xiàn)在花芽分化啟動期和小花原基分化中期;盛花期表達量較高。
　　 6.從菊花‘神馬’中克隆得到開花相關基因CmCOL的cDNA全長序列，登錄號為KC589293，對其做序列信息分析;菊花CmCOL mRNA在葉中高表達，呈晝夜節(jié)律表達模式，表達高峰值出現(xiàn)在04:00;短日照處理能上調(diào)葉中CmCOL，對芽中的影響不明顯;不同花芽分化階段葉片

10、中高峰值出現(xiàn)在小花原基分化中期;盛花期葉片中高表達。
　　 7.菊花CmFTL mRNA只在短日照條件下的葉片中呈現(xiàn)節(jié)律表達，00:00時為高峰值;芽中及長日照葉、芽中均檢測不到晝夜起伏;不同花芽分化階段葉片中CmFTLmRNA水平差異大，小花原基分化中期達最高峰值;花蕾期葉中高表達。
　　 8.研究顯示菊花葉片感應光周期，短日照條件下CmGI首先于暗處理1d后啟動上調(diào)，花芽分化啟動期出現(xiàn)第一個峰值，而CmCOL則滯后C