牡丹花芽休眠解除相關(guān)基因PsPⅡ的克隆及其表達(dá)的初步分析.pdf

1、為闡明PsPⅡ基因的生物學(xué)功能和深入理解低溫解除植物花芽休眠的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選用山東菏澤牡丹基地4年生牡丹品種‘魯荷紅’(Paeonia suffruticosa Andr.‘Lu HeHong’)的健壯植株，在不同低溫處理下研究PsPⅡ基因的表達(dá)變化及植株的生理生化變化。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.形態(tài)觀察結(jié)果表明，感受低溫0d的牡丹，花芽不會(huì)發(fā)生萌動(dòng);說(shuō)明低溫是使牡丹花芽萌動(dòng)的必要條件。感受恒低溫15d，牡丹‘魯荷紅’休

2、眠基本解除;感受恒低溫天數(shù)23d，休眠徹底解除;說(shuō)明感受恒低溫的牡丹‘魯荷紅’花芽休眠解除的底限為15d，15-23d牡丹休眠徹底解除。
　　 2.5'-RACE PCR擴(kuò)增，得到439bp的5'-末端片段，拼接得到899bp的PsPⅡ全長(zhǎng)cDNA。其中，5'非編碼區(qū)(UTR)為70 bp，3'UTR為226bp，包括24個(gè)堿基的poly(A)尾，并含有一個(gè)完整的ORF為603bp，編碼200個(gè)氨基酸。該序列在GenBank獲得

3、的登錄號(hào)為HQ699900。
　　 3.對(duì)PsPⅡ全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)牡丹PⅡ蛋白是一種親水性的非分泌型蛋白，可能定位于胞質(zhì)中，PsPⅡ主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)是α-螺旋。預(yù)測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)可能是一種花芽胞內(nèi)C/N水平的感應(yīng)蛋白，而且與谷氨酰胺合成酶的功能密切相關(guān)。同源性分析得出，與牡丹PⅡ蛋白同源性最高的是水稻的PⅡ類(lèi)蛋白，同源性達(dá)83.62％，與牡丹PⅡ蛋白位于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的同一分枝。接下來(lái)依次與牡丹PⅡ氨基酸序列同源性

4、較高的為煙草、擬南芥和松樹(shù)。
　　 4.熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著感受低溫天數(shù)的增加，在整個(gè)牡丹內(nèi)休眠解除的進(jìn)程中，PsPⅡ基因的表達(dá)量不斷增加，當(dāng)?shù)蜏?5d時(shí)，該基因的表達(dá)量達(dá)到最高。northern檢測(cè)無(wú)信號(hào)。
　　 5.對(duì)不同處理的牡丹花芽分別進(jìn)行碳水化合物、淀粉、可溶性蛋白、游離氨基酸4個(gè)生理指標(biāo)的測(cè)定，并將其換算成C/N水平。結(jié)果表明胞內(nèi)C/N水平變化趨勢(shì)和可溶性碳水化合物含量與五個(gè)低溫處理的PsPⅡ

5、基因在RNA水平上的變化趨勢(shì)基本吻合;顯著性分析可知，當(dāng)感受低溫15d時(shí)，α=0.05水平下，C/N與可溶性碳水化合物含量極顯著。測(cè)定五個(gè)低溫處理水平下的谷氨酰胺合成酶活性的變化，其趨勢(shì)與PsPⅡ基因表達(dá)量的變化也相一致;先升高很快，后升高較慢，在低溫15d時(shí)，達(dá)到最高點(diǎn)。相關(guān)系數(shù)分析可知，PsPⅡ基因表達(dá)量與GS活性的相關(guān)程度最高，為0.6813;可溶性碳水化合物含量次之，其次是C/N比，相關(guān)系數(shù)分別為0.6538和0.5937，三者