中國櫻桃花芽休眠相關(guān)MADs-box轉(zhuǎn)錄因子克隆與功能分析.pdf

1、中國櫻桃（Prunus pseudocerasus）屬薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)李屬（Prunus），是我國重要的栽培果樹之一。其果實(shí)具有璀璨晶瑩、形嬌味美、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者喜愛。中國櫻桃與其它落葉果樹一樣，都有典型自然休眠現(xiàn)象。休眠是果樹渡過溫帶嚴(yán)寒的一種方式，若花芽不能正常解除休眠，則會(huì)出現(xiàn)開花不整齊、坐果率低等問題，直接影響果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量。落葉果樹休眠是十分復(fù)雜的過程，目前認(rèn)為足夠的低溫積

2、累是誘導(dǎo)中國櫻桃花芽休眠解除的關(guān)鍵因素之一。但由于缺少中國櫻桃基因組信息，花芽休眠的分子機(jī)制仍不清楚。因此本研究利用RNA-Seq技術(shù)構(gòu)建了中國櫻桃優(yōu)良品種‘短柄櫻桃’（Prunuspseudocerasus cv.‘Duanbing’）花芽轉(zhuǎn)錄組均一化文庫和不同休眠狀態(tài)花芽的數(shù)字基因表達(dá)譜(Digital Gene Expression Profiling，DGE)，并篩選了差異表達(dá)基因(Differentially Expresse

3、d Genes，DEGs)，分析了該轉(zhuǎn)錄組中具有全長序列的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，克隆了3個(gè)與櫻桃花芽休眠相關(guān)的MADS基因(Dormancy associated MADS-box，DAM)，為進(jìn)一步揭示低溫誘導(dǎo)中國櫻桃花芽休眠解除的分子生物學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　主要結(jié)果如下:
　　(1)通過對(duì)櫻桃休眠花芽均一化轉(zhuǎn)錄組文庫測序，獲得了Clean reads47，599，914個(gè)，最終拼接獲得平均序列長度為837

4、bp的Unigene序列50，604條，GO功能分類結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)有16，186個(gè)Unigene被分別注釋到生物學(xué)過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細(xì)胞組分(cellular component)。利用KEGG數(shù)據(jù)庫，將21，143個(gè)Unigenes序列被分別注釋到128個(gè)代謝通路。其中比例最高的是代謝途徑(KO01100:5077 Unigenes，24.01％)，其次是次生

5、代謝物合成途徑(KO01110:2518 Unigenes，11.91％)，植物病原交互途徑(KO04626:1381 Unigenes，6.53％)以及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(KO04075:1048 Unigenes，4.96％)。
　　(2)利用RNA-seq技術(shù)構(gòu)建了深度休眠期、50％休眠解除期和100％休眠解除期的櫻桃花芽(FB0、FB365、FB724) DGE。通過兩兩文庫比對(duì)，分析發(fā)現(xiàn)三個(gè)文庫得到總clean rea

6、ds都高于6M，其中FB0-VS-FB365有259個(gè)上調(diào)和1385個(gè)下調(diào)DEGs; FB0-VS-FB724有1103個(gè)上調(diào)和1853個(gè)下調(diào)DEGs; FB365-VS-FB724有940個(gè)上調(diào)和513個(gè)下調(diào)DEGs。通過GO功能分析顯示(P≤0.05)，在FB0-VS-FB365中富集的10個(gè)GO條目，其中最顯著的是光合膜(photosyntheticmembrane)，F(xiàn)B365-VS-FB724中富集的有1個(gè)GO條目，為細(xì)胞外區(qū)

7、域(extracellular region)，在FB0-VS-FB724中富集的有4個(gè)GO條目。Pathway分析表明(Q≤0.05)，F(xiàn)B0-VS-FB365、FB365-VS-FB724和FB0-VS-FB724中分別有889、909和1712個(gè)DEGs各被注釋到111、111和120的KEGG代謝通路，涉及多種代謝途徑。在FB0-VS-FB365、FB365-VS-FB724、FB0-VS-FB724中分別有572(64.3％)

8、、771(84.8％)、1385(80.9％)個(gè)DEGs被分別注釋到13、16、17個(gè)代謝通路。隨機(jī)挑選DEGs的Q-PCR數(shù)據(jù)與RNA-Seq的數(shù)據(jù)變化趨勢基本一致，呈極顯著水平，說明基于RNA-Seq分析的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)結(jié)果具有較高可信性的。
　　(3)從櫻桃花芽轉(zhuǎn)錄組分析中，獲得18個(gè)具有全長開放閱讀框的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子(PpcMADS)，對(duì)它們編碼的氨基酸基本性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)分析結(jié)果表明，除KP347550和K

9、P347552以外，均屬于MIKC家族，大部分為不穩(wěn)定堿性親水蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)中同時(shí)含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、擴(kuò)展鏈和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋所占比例最高。亞細(xì)胞定位分析顯示，MADS-box蛋白主要定位在細(xì)胞核中，而KP347549、KP347545和KP347552分別定位到細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜的幾率較高。序列主要含有四個(gè)保守基序，其中基序1為該基因家族的保守基序，含有MADS盒。PpcMADS轉(zhuǎn)錄因子可以分為AP3亞組、PI亞組、SHP亞

10、組、AG亞組、AP1亞組、SEP亞組、SOC亞組、SVP亞組及4個(gè)未知亞組。KM243368、KM243373、KM243375、KP347546、KP347547、KP347551和KP347552只在花中表達(dá)，KM243377和KP347550在花和果實(shí)中均不表達(dá)，其他9個(gè)基因在兩個(gè)組織中都表達(dá)。
　　(4)進(jìn)一步使用RACE技術(shù)克隆了3個(gè)與花芽休眠相關(guān)MADS轉(zhuǎn)錄因子(PpcDAM)，聚類分析結(jié)果表明，這3個(gè)基因分別與桃、梅

11、的休眠相關(guān)MADS轉(zhuǎn)錄因子DAM4、DAM5和DAM6單獨(dú)聚成一支，且與李屬植物的MADS-box基因關(guān)系最近，分別將三個(gè)基因命名為PpcDAM4、PpcDAM5和PpcDAM6，其基因表達(dá)與休眠解除過程具有相似趨勢。隨著內(nèi)休眠的解除，呈下調(diào)表達(dá)，在生態(tài)休眠期維持較低水平，推測認(rèn)為這3個(gè)基因可能對(duì)花芽休眠具有調(diào)控作用。為進(jìn)一步分析基因表達(dá)模式，克隆了PpcDAM4基因啟動(dòng)子，對(duì)該啟動(dòng)子序列進(jìn)行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)該序列中除含有高等植物基因啟動(dòng)

12、子特征功能元件，還含有CRT/DRE識(shí)別位點(diǎn)，通過雙熒光素酶瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)C-repeat binding transcriptionfactor(CBF)對(duì)該啟動(dòng)子具有促進(jìn)調(diào)控作用，認(rèn)為低溫響應(yīng)可能是通過CBF途徑介導(dǎo)的。另外，將PpcDAM6基因遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，通過種子萌發(fā)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因種子明顯受到抑制，說明該基因在櫻桃花芽中被低溫誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)花芽的萌發(fā)具有抑制作用。根據(jù)以上研究結(jié)果，我們認(rèn)為PpcDAM基因可能參與了中國櫻桃花芽