番茄MADS-box轉(zhuǎn)錄因子SlFYFL調(diào)控衰老和果實(shí)成熟的分子機(jī)理研究.pdf

1、MADS-box蛋白是一類廣泛存在于真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子家族。在高等植物中MADS-box蛋白主要在果實(shí)成熟、脫落，器官衰老及花器官的形成等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。2002年，通過(guò)圖位克隆法，Vrebalov等找到了MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子 SlMADS-RIN，并證明其為影響番茄果實(shí)成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，且作用于乙烯合成途徑。為進(jìn)一步分析番茄MADS-box家族中其他未知基因的功能，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，分離和克隆到一個(gè)與擬南芥

2、 MADS-box蛋白 AtFYF（AtAGL42）直系同源且與 SlMADS-RIN蛋白相似度較高的番茄 SlFYF-Like(SlMBP18)蛋白，并登錄到了NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank登錄號(hào)：KF709444）。
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)SlFYFL基因的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，SlFYFL基因在番茄葉片，果實(shí)，果柄離區(qū)和萼片中大量表達(dá)，表明該基因可能與葉片發(fā)育，果實(shí)成熟及脫落等生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系密切。為進(jìn)一步探索和分析該基因的生

3、理學(xué)功能及其作用機(jī)理，我們分別構(gòu)建了SlFYFL基因的超表達(dá)和RNAi沉默載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其分別成功轉(zhuǎn)入野生型番茄中，并培育出SlFYFL超表達(dá)及沉默的轉(zhuǎn)基因番茄株系。
　　對(duì)SlFYFL超表達(dá)及沉默轉(zhuǎn)基因番茄株系的研究結(jié)果表明：1. SlFYFL基因可能通過(guò)參與調(diào)控乙烯相關(guān)基因的表達(dá)而調(diào)節(jié)番茄葉片葉綠素的含量來(lái)調(diào)控番茄葉片的衰老程度。超表達(dá)SlFYFL基因的番茄葉片衰老推遲，葉綠素含量升高，光合作用相關(guān)基因（Slcab7

4、和SlrbcS）表達(dá)明顯上調(diào)，乙烯合成相關(guān)基因（ACO1、ACO3、ACS1A、ACS2和ACS6）表達(dá)顯著降低，而沉默轉(zhuǎn)基因番茄葉片則表現(xiàn)出與超表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄葉片相反的表型；2. SlFYFL基因可能通過(guò)參與調(diào)控乙烯相關(guān)基因的表達(dá)而調(diào)節(jié)番茄果實(shí)的成熟。超表達(dá)SlFYFL基因的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)成熟時(shí)間推遲，類胡蘿卜素積累量降低，貯藏時(shí)間變長(zhǎng)，果實(shí)硬度增加，乙烯合成量降低，而沉默轉(zhuǎn)基因株系果實(shí)的系列指標(biāo)與超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系果實(shí)相反。果實(shí)成熟相

5、關(guān)基因，類胡蘿卜素合成基因（SlPSY1，SlPDS及SlZDS），細(xì)胞壁代謝基因（SlPG、SlEXP1、SlXTH5及SlTBG4）和脂肪酸代謝基因（SlTomLoxA，SlTomLoxB及SlTomLoxC）的表達(dá)在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因果實(shí)中受到明顯抑制，而在沉默轉(zhuǎn)基因果實(shí)中顯著上調(diào)；乙烯合成相關(guān)基因（RIN、ACS2、ACO1及ACO3）及乙烯響應(yīng)基因（E4和E8）在沉默轉(zhuǎn)基因果實(shí)中顯著上調(diào)，而在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因果實(shí)中受到明顯抑制。果實(shí)硬度

6、測(cè)定結(jié)果表明，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因果實(shí)的硬度明顯大于野生型同時(shí)期的果實(shí)而沉默轉(zhuǎn)基因果實(shí)的硬度較野生型的明顯降低。耐貯藏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因果實(shí)的貯藏時(shí)間明顯長(zhǎng)于野生型番茄，而沉默轉(zhuǎn)基因番茄的貯藏時(shí)間比野生型顯著縮短。果實(shí)乙烯含量測(cè)定顯示，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因果實(shí)的乙烯合成量?jī)H為野生型的40％-50%，而沉默轉(zhuǎn)基因果實(shí)的乙烯合成量比野生型果實(shí)高3.5倍以上，表明SlFYFL可能在乙烯上游發(fā)揮作用而調(diào)控番茄果實(shí)的成熟；3. SlFYFL參與了乙烯相關(guān)的離

7、區(qū)發(fā)育過(guò)程。表型觀察發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)SlFYFL基因的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)脫落推遲，而沉默轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)脫落提前。顯微鏡觀察結(jié)果顯示，果柄離區(qū)中離層細(xì)胞的形成在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄果柄離區(qū)中的發(fā)育推遲而在沉默轉(zhuǎn)基因番茄果柄離區(qū)中顯著提前。斷裂力度測(cè)試發(fā)現(xiàn)，拉斷超表達(dá)轉(zhuǎn)基因果柄離區(qū)所需斷裂力度相比野生型增大，拉斷沉默轉(zhuǎn)基因果柄離區(qū)所需斷裂力度相比野生型減小。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，離區(qū)發(fā)育相關(guān)基因（SlMADS-MC、JOINTLESS、Bl、W

8、US、Ls及GOB）的表達(dá)在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的果柄離區(qū)中明顯下調(diào)，而在沉默轉(zhuǎn)基因株系的果柄離區(qū)中顯著上調(diào)；乙烯合成相關(guān)基因（ACS4、ACS2、ACS1A、ACO1及 ACO3）的表達(dá)在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的果柄離區(qū)中顯著下調(diào)而在沉默轉(zhuǎn)基因株系的果柄離區(qū)中明顯提高，說(shuō)明SlFYFL基因可能通過(guò)乙烯來(lái)調(diào)控離區(qū)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)果柄離區(qū)的發(fā)育。
　　由于MADS-box蛋白通常形成同源或異源二聚體發(fā)揮調(diào)控作用。因此，本研究進(jìn)一步探

9、索了番茄中相關(guān) MADS-box蛋白的相互作用。酵母雙雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SlFYFL可與其自身，番茄果實(shí)成熟相關(guān)的SlMADS-RIN、SlMADS1蛋白之間分別發(fā)生相互作用，說(shuō)明SlFYFL可能通過(guò)與SlMADS-RIN和SlMADS1相互作用而影響乙烯進(jìn)而調(diào)控番茄的果實(shí)成熟。此外，SlFYFL還可與番茄離區(qū)發(fā)育相關(guān)的JOINTLESS蛋白相互作用，且JOINTLESS可與番茄離區(qū)發(fā)育相關(guān)的SlMADS-MC相互作用，說(shuō)明SlFYFL蛋白