農(nóng)桿菌介導(dǎo)的MADS-box基因轉(zhuǎn)化黃瓜初步研究.pdf

1、黃瓜是一種重要的蔬菜作物。長(zhǎng)期以來(lái)，主要采用傳統(tǒng)育種方法培育新品種。黃瓜的遺傳基礎(chǔ)狹窄，存在遠(yuǎn)緣雜交障礙，種質(zhì)資源拓寬困難。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們開(kāi)始利用基因轉(zhuǎn)化培育植物新品種。由于黃瓜的離體組織培養(yǎng)技術(shù)及轉(zhuǎn)化體系并不完善，成苗分化率低，轉(zhuǎn)化率低，因此建立一個(gè)穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)化體系十分有必要，并且能夠?yàn)榛蚬δ芊治龃蛳禄A(chǔ)。 當(dāng)前，植物花發(fā)育機(jī)制已成為植物分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。CSMADS06基因是從黃瓜中克隆到的MADS-

2、box的同源基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)與incomposita protein (Antirrhinum majus,CAG27846)，SVP-like floral repressor (Eucalyptus grandis,AAP33087)，short vegetative phase transcription factor (Arabidopsis thaliana,NP_179840)，以及MADS-box protein

3、JOINTLESS (LeMADS,Q9FUY6)的同源性分別為：70％、72％、68％、69％。因此認(rèn)為CSMADS06基因在植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變方面起作用。 本試驗(yàn)選用煙草和兩種不同品系的黃瓜S06和S52為材料，分別以葉盤和子葉為外植體，將CSMADS06基因通過(guò)根癌農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。以期建立一個(gè)穩(wěn)定高效的黃瓜轉(zhuǎn)化體系，獲得轉(zhuǎn)基因植株，為CSMADS06基因的功能鑒定奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：

4、 1. 從10種含不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，篩選出適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+1.5mg/L BA+0.5mg/L ABA+2.0mg/L AgNO3。試驗(yàn)結(jié)果表明，相同誘導(dǎo)條件下，基因型對(duì)子葉的再生頻率有明顯影響，S06較易再生出芽，且每外植體上再生芽較多，最高再生率為93.3％。S52是個(gè)長(zhǎng)勢(shì)較弱的品系，植株較小，節(jié)間短，多表現(xiàn)簇生，不易伸長(zhǎng)生長(zhǎng),最高再生率為83.3％。 2. 在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)和伸長(zhǎng)階段，除草劑的

5、最佳臨界濃度為5.0mg/L。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.5mg/L BA+0.5 mg/L ABA+2.0mg/L AgNO3+400mg/L Cef+5.0mg/L PPT。伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS+0.05mg/L BA+100mg/L Cef+5.0mg/L PPT；在生根階段，除草劑的最佳臨界濃度為2.0mg/L。生根培養(yǎng)基為MS+100mg/L Cef+2.0mg/L PPT。 3. 經(jīng)過(guò)除草劑篩選，煙草的592個(gè)外植體，共獲得

6、14株轉(zhuǎn)化植株，陽(yáng)性率為2.36％。經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)和GFP熒光檢測(cè)證實(shí)，外源基因已轉(zhuǎn)入這些植株中，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。S06的366個(gè)外植體，共獲得15株轉(zhuǎn)化植株；S52的451個(gè)外植體，共獲得13株轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，均能擴(kuò)增出約800bp大小的目的片段，接著進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)化植株的標(biāo)記基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，同樣能擴(kuò)增出約500bp大小的目的片段，進(jìn)一步佐證外源的CSMADS06基因已轉(zhuǎn)入這些植株中。S06和S52的陽(yáng)性率分別