低溫解除牡丹內(nèi)休眠進(jìn)程中的DNA甲基化分析.pdf

1、牡丹反季節(jié)催花是其產(chǎn)業(yè)的主要內(nèi)容之一，生產(chǎn)中常出現(xiàn)催花不良甚至催花失敗的問題，嚴(yán)重影響了牡丹產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，深入理解內(nèi)休眠解除的基因調(diào)控機(jī)理是解決生產(chǎn)中存在問題的理論基礎(chǔ)。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式之一，在基因表達(dá)調(diào)控、生長發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。本研究擬探討基因組DNA甲基化在牡丹休眠解除中的作用，并進(jìn)一步分離甲基化模式發(fā)生變化的基因片段。分別在牡丹感受不同低溫時(shí)間期間外施GA3和SAM，利用高效液相色譜技術(shù)（HPLC）和D

2、NA甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)(MSAP)分析了不同處理的甲基化變化，篩選了休眠解除進(jìn)程中甲基化模式變化的DNA片段。
　　 1)2009年11月10日樣品移入冷庫，0-4℃低溫處理18 d可解除‘魯荷紅’內(nèi)休眠;‘鳳丹’需冷量低于‘魯荷紅’，低溫15d即可完全解除休眠，隨后進(jìn)入生態(tài)休眠階段。
　　 2)2010年11月24日‘魯荷紅’移入冷庫，0-4℃低溫12d即可解除其休眠，隨后進(jìn)入生態(tài)休眠。低溫6d加500 mg/L

3、 GA3處理的‘魯荷紅’萌動(dòng)率和成花率達(dá)100％，并可縮短萌動(dòng)時(shí)間。10μmol/L的SAM處理在低溫量不足時(shí)能夠促進(jìn)萌動(dòng)。
　　 3) HPLC法測(cè)定了2010年低溫、500 mg/L GA3、10μmol/L SAM處理的‘魯荷紅’甲基化水平。內(nèi)休眠期的牡丹花芽甲基化水平很高，低溫處理0d、6d、12 d、18d和24 d分別為81.67％、77.14％、84.07％、60.92％和71.71％，總體呈下降的趨勢(shì)，但休眠解除

4、時(shí)甲基化水平較高。SAM可提高花芽內(nèi)DNA甲基化水平。
　　 4)利用9個(gè)EcoRⅠ和8個(gè)HpaⅡ/MspⅠ引物組合成72對(duì)引物對(duì)2009年樣品進(jìn)行了MSAP分析，共擴(kuò)增出1550帶。內(nèi)休眠期的牡丹花芽甲基化程度高，以半甲基化狀態(tài)為主，甲基化位點(diǎn)數(shù)占總位點(diǎn)的60％以上，低于HPLC法測(cè)定的甲基化水平。‘魯荷紅’低溫0d、6d、12d、18d、24d所能檢測(cè)出的基因位點(diǎn)數(shù)分別為1248個(gè)、923個(gè)、1180個(gè)、1336個(gè)和1332

5、個(gè)，總甲基化比率分別為73.9％、73.2％、66.7％、76.3％和57.1％。鳳丹低溫0d、6d、10d、15d、18d、24 d和萌動(dòng)后的樣品所能檢測(cè)出的基因位點(diǎn)數(shù)分別為1024個(gè)、1189個(gè)、1325個(gè)、865個(gè)、1364個(gè)、704個(gè)和1222個(gè)，總甲基化比率分別為61％、56.1％、38.2％、39.6％、33.7％、64.4％和48.2％。伴隨著低溫累積，花芽內(nèi)總甲基化水平總體呈下降趨勢(shì)，生態(tài)休眠階段總甲基化水平又有所升高。

6、
　　 5)伴隨著低溫累積，去甲基化位點(diǎn)逐漸增加而過甲基化位點(diǎn)數(shù)逐漸減少。與未經(jīng)低溫處理相比，‘魯荷紅’低溫6 d、12d、18d和24 d去甲基化的位點(diǎn)數(shù)分別為211、280、353和513，分別占總位點(diǎn)數(shù)的15.2％、20.6％、24.2％和35.4％;過甲基化位點(diǎn)數(shù)分別為581、295、276和197，分別占總位點(diǎn)數(shù)的41.9％、21.8％、18.9％和13.6％，與休眠解除進(jìn)程相吻合。
　　 綜上，低溫處理進(jìn)程中