癌睪丸抗原Psp32基因的克隆、表達(dá)及純化.pdf

1、目的 為了探討Psp32抗原在臨床腫瘤診斷及治療中的價(jià)值，開(kāi)發(fā)和利用該抗原，本實(shí)驗(yàn)克隆癌睪丸抗原Psp32基因，體外表達(dá)該基因，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化及鑒定。 方法 (1)提取人睪丸組織總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA；(2)應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增Psp32基因完整的開(kāi)放閱讀框架；(3)插入原核表達(dá)載體pMAL-C2，將構(gòu)建pMAl-C2/Psp32重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α菌，通過(guò)藍(lán)白斑篩選、PCR鑒定、內(nèi)切酶鑒定和D

2、NA測(cè)序篩出正確的pMAL-C2/Psp32重組質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)化TB<,1>菌進(jìn)行表達(dá)；(4)用IPTG對(duì)pMAL-C2/Psp32進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)IPTG濃度和加入時(shí)機(jī)以及誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化；(5)通過(guò)SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)的MBP-Psp32融合蛋白，并用Quantityone凝膠分析軟件分析，尋找出TB<,1>宿主菌的最佳誘導(dǎo)條件；(6)融合蛋白經(jīng)Amylose-resin親和層析柱純化，并通過(guò)factorXa酶切

3、，再次過(guò)Amylose-resin親和層析柱得到純化的Psp32，將純化的Psp32蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定。 結(jié)果 重組質(zhì)粒pMAL-C2/Psp32測(cè)序與已知序列相同；成功誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白MBP-Psp32。確定了pMAL-C2/Psp32體外表達(dá)的優(yōu)化條件：37℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí)，加入終濃度為0.3mmol/L的IPTG，繼續(xù)在30℃振蕩培養(yǎng)5小時(shí)；蛋白質(zhì)飛行質(zhì)譜儀分析所得的肽段與目的蛋白相符。 結(jié)論