TRAIL胞膜外段基因克隆、表達(dá)及其純化.pdf

1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文TRAIL胞膜外段基因克隆、表達(dá)及其純化姓名：周海勝申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：劉賢錫田方2001.5.14將TRAIL基因的胞膜外段插入表達(dá)載體pGEX一2T，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX／TRAILex，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5c【，提取重組DNA，用酶切、PCR擴(kuò)增來(lái)鑒定陽(yáng)性克隆，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GSTTRAIL蛋白的胞膜外段；使用親和層析的方法純化目的蛋白，將純化的融合蛋白作用于U937細(xì)

2、胞，用FACS檢測(cè)表達(dá)的目的蛋白是否具有生物學(xué)活性。結(jié)果：抗CD3McAb能誘導(dǎo)正常人外周血中淋巴細(xì)胞的TRAIL的表達(dá)，成功地克隆了TRAIL基因及其胞膜外段，構(gòu)建了重組表達(dá)載體DGEX／TRAILex，IPTG誘導(dǎo)后可得到高度表達(dá)的TRAIL蛋白胞膜外段，經(jīng)12％SDS～PAGE分析，可觀察到一分子量和理論值相符(約54kD)的誘導(dǎo)表達(dá)帶。GST—TRAIL胞膜外段融合蛋白的表達(dá)量占菌體蛋白總量的28％，進(jìn)一步分析表明TRAIL蛋白

3、的胞膜外段主要以可溶性的形式表達(dá)，用GSTAgarose4B層析柱純化超聲破菌后的上清，每升細(xì)菌培養(yǎng)液可得到i05mg純度在90％以上GSTTRAIL胞膜外段的融合蛋白。在20。C用IPTG誘導(dǎo)重組菌表達(dá)的目的蛋白主要以可溶性的形式存在；不同濃度的IPTG對(duì)融合蛋白表達(dá)量影響較??；0immol／LIPTG在20。c誘導(dǎo)4小時(shí)后，目的蛋白的表達(dá)達(dá)峰值。Western—blot結(jié)果證實(shí)54kD的表達(dá)帶可與鼠抗TRAILMcAb起特異性反應(yīng)。