人類睪丸特異表達(dá)新基因MAEL的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、精子生成是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過程，多個(gè)與精子發(fā)生相關(guān)的基因已相繼被鑒定。但這些已知的基因如何與其它的基因相互作用來調(diào)控精子的生成過程，以及是否存在其它未知的基因參與精子的發(fā)生目前尚不完全清楚?？寺⌒碌牟G丸發(fā)育、生精相關(guān)基因?qū)M(jìn)一步了解精子發(fā)生機(jī)理具有重要意義。
　　 本文利用數(shù)字差異顯示(digital differential display)方法，從篩查人睪丸中高表達(dá)而在其他組織中不表達(dá)或低表達(dá)的差異EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)

2、入手，成功克隆到一個(gè)在人睪丸中高表達(dá)的新基因MAEL(GenBank登錄號(hào)為：DQ076156)。RLM—RACE結(jié)果表明，MAEL基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始位點(diǎn)上游第74位核苷酸(nt)，MAEL基因的mRNA全長(zhǎng)序列為1751 nt。生物信息學(xué)分析顯示：MAEL基因位于人類1號(hào)染色體長(zhǎng)臂上(1q24.1)，由12個(gè)外顯子組成和11個(gè)內(nèi)含子所組成，編碼434個(gè)氨基酸，分子量約為49.2kD。
　　 Northern印跡雜交

3、結(jié)果表明，MAEL基因的mRNA只在睪丸組織中高表達(dá)，而在卵巢、肺、肝臟、心、腦、脾臟、腎臟等組織中無表達(dá)。RNA原位雜交結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)MAEL基因的mRNA在精母細(xì)胞、圓形精子和早期伸長(zhǎng)型精子中都有表達(dá)。EGFP—MAEL融合表達(dá)載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MAEL基因編碼蛋白質(zhì)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。
　　 為了進(jìn)一步了解該基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，本文分析了MAEL基因的啟動(dòng)子。首先，將MAEL基因的上游序列(—1510 bp～+150 bp

4、)克隆到載體pTAL—luc的熒光素酶基因上游并構(gòu)建一系列缺失突變，然后將包含全長(zhǎng)序列和各種缺失突變的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和小鼠精原細(xì)胞系GC—1，通過比較熒光素酶的活性發(fā)現(xiàn)，MAEL基因的基本啟動(dòng)子位于—216 bp與+28bp之間，而+28 bp至+150 bp處有精原細(xì)胞系特異表達(dá)的增強(qiáng)子序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MAEL基因啟動(dòng)子缺乏TATA盒，而存在3個(gè)CACCC盒，1個(gè)CCAAT盒和1個(gè)倒轉(zhuǎn)的CCAAT盒(ATT