睪丸特異表達(dá)基因LM23的性質(zhì)和功能研究.pdf

1、哺乳動物的精子發(fā)生是一個復(fù)雜而獨(dú)特的細(xì)胞增殖與分化的過程，其中包括精原細(xì)胞的有絲分裂增殖，精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和精子細(xì)胞的變態(tài)過程，最終形成成熟的精子。精子發(fā)生過程涉及復(fù)雜的形態(tài)變化、遺傳重組及染色體倍數(shù)的減半。這一過程是一個受到精細(xì)調(diào)節(jié)的眾多基因參與的復(fù)雜而有序的過程。因此，篩選和研究精子發(fā)生過程中起重要作用的特異表達(dá)基因，對研究精子發(fā)生的分子機(jī)制，探討男性不育的分子機(jī)理，尋找新的診斷和治療措施及研究新的節(jié)育手段具有重要意義。
　

2、　 LM23基因是本實(shí)驗(yàn)室克隆出的一條新基因，前期的初步研究提示，它是一個新的大鼠精子發(fā)生相關(guān)基因。BLAST工具對LM23基因的同源基因進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，LM23基因與小鼠、人類的speedy homolog A（Spdya，Speedy）基因具有同源性。本研究對該基因在精子發(fā)生過程中的明確作用及其機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　 首先我們對該基因的表達(dá)特性進(jìn)行了進(jìn)一步的鑒定。利用RT-PCR檢測了LM23基因在正常大鼠的心、肝、脾、

3、肺、腎、腦、卵巢、睪丸、肌肉組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示睪丸組織有較高水平的LM23基因表達(dá)，其余組織均為陰性，從而提示LM23基因的表達(dá)具有睪丸特異性。分離9天齡雄性SD大鼠A型精原細(xì)胞及成年大鼠粗線期精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示該基因在精母細(xì)胞中表達(dá)量最高，顯著高于精原和精子細(xì)胞的表達(dá)量；原位雜交檢測結(jié)果也提示LM23基因主要在精母細(xì)胞中表達(dá)。這些結(jié)果說明LM23基因的表達(dá)具有組織特異性和階段特異性的特點(diǎn)。

4、>　　 為了探討LM23基因在精子發(fā)生中的功能，本研究針對LM23基因序列，設(shè)計(jì)了4個RNA干擾靶點(diǎn)序列，克隆到慢病毒載體上，篩選出含目的序列的慢病毒載體，包裝成病毒顆粒。選5周齡的雄性SD大鼠為研究對象，經(jīng)睪丸輸出管注射法將上述包裝好的病毒顆粒注射到睪丸。實(shí)驗(yàn)組注射液中含干擾片段病毒，對照組含無關(guān)片段病毒，單側(cè)注射，未注射側(cè)睪丸作為空白對照。注射后4周，拉頸處死大鼠，開腹取出睪丸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射干擾病毒的睪丸比對照側(cè)右側(cè)睪丸略小，且

5、附睪也沒有右側(cè)附睪飽滿；而注射對照病毒的睪丸與對側(cè)睪丸比較無明顯差異。在體式熒光顯微鏡下觀察，可見已經(jīng)在大鼠睪丸表達(dá)慢病毒載體的綠色熒光蛋白。在熒光顯微鏡下觀察睪丸冰凍切片，顯示生精上皮細(xì)胞中有綠色熒光表達(dá)，說明慢病毒顆粒已成功轉(zhuǎn)染生精細(xì)胞。Real-time PCR檢測注射后2周和4周的實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白對照組睪丸LM23的表達(dá)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組LM23的表達(dá)顯著降低，與對照組比較，2周和4周表達(dá)量分別減低了69％和87％。通過Wes

6、tern blot方法檢測干擾側(cè)大鼠組睪丸中LM23蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)RNA干擾大鼠睪丸未LM23蛋白表達(dá)。這些結(jié)果提示成功建立LM23基因沉默大鼠模型。
　　 睪丸組織切片HE染色檢查，結(jié)果顯示干擾側(cè)睪丸的精曲小管組織紊亂，有斷裂和生精細(xì)胞脫落至管腔的現(xiàn)象，生精細(xì)胞發(fā)育阻滯在精母細(xì)胞階段。鏡下大約可以觀察到三種類型的精曲小管，在Ⅰ型管中含有3-4層的精母細(xì)胞；在Ⅱ型管中含更多的精母細(xì)胞，并且細(xì)胞有向管腔中脫落的現(xiàn)象

7、，管腔中有伊紅染色很重的細(xì)胞；在Ⅲ型管腔中僅有1-2層精原細(xì)胞和支持細(xì)胞，管腔空洞。對照側(cè)附睪中充滿成熟精子，而干擾側(cè)附睪管的管腔縮小，未見成熟精子。TUNEL檢測LM23基因沉默后睪丸顯示，在一些精曲小管中有大量的凋亡細(xì)胞存在，而這些精曲小管與上述提到的Ⅱ型管基本對應(yīng)，而在對應(yīng)的Ⅰ型管腔和Ⅲ型管腔中存有少量的凋亡細(xì)胞，而在對照側(cè)睪丸則幾乎未檢測到凋亡細(xì)胞。根據(jù)這些結(jié)果推測，LM23基因沉默通過某種機(jī)制引起精子發(fā)育到精母細(xì)胞階段發(fā)生阻滯

8、，造成了精母細(xì)胞在精曲小管中堆積，出現(xiàn)了Ⅰ型管中所觀察到的現(xiàn)象。由于這些精母細(xì)胞不能繼續(xù)分化可能啟動了凋亡通路而發(fā)生凋亡，出現(xiàn)了Ⅱ型管中所觀察到的現(xiàn)象；最后由于凋亡細(xì)胞被清除而出現(xiàn)了Ⅲ型管中所觀察到的現(xiàn)象。
　　 為了探討LM23基因的作用機(jī)制，本研究利用大鼠全基因組芯片篩查LM23基因沉默引起的睪丸表達(dá)譜的改變狀況，并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證和分析?；蛐酒Y(jié)果分析顯示，LM23基因沉默大鼠睪丸發(fā)生大量的基因表達(dá)改變，其中包括多個精