人睪丸特異表達基因TDRG1編碼蛋白質功能的初步研究.pdf

1、男性不育發(fā)生和發(fā)展是一個多基因參與的復雜過程，近年來發(fā)現有很多基因參與了這一過程，其中有不少基因的功能已被明確。這些已知的基因如何與其它的基因相互作用來調控精子的生成過程，以及是否存在其它的未知基因參與精子的發(fā)生目前尚不完全清楚。因此克隆新的睪丸發(fā)育、生精相關基因并進一步闡明其功能是了解生殖細胞發(fā)生機理和生物學過程的關鍵，對闡明精子的發(fā)生的生理、病理具有重要意義。
　　 我院泌尿外科長期以來致力于男性不育領域的臨床和基礎方面的研

2、究，并積累了豐富的研究資料。2005年我科蔣先鎮(zhèn)、陽建福等采用生物信息學分析結合實驗驗證的方法克隆了一個在人類睪丸組織中特異性高表達的新基因(GenBank登錄號為DQ168992)，命名為TDRG1(Testis Development Related Gene1)。生物信息學預測表明，TDRG1基因含有303bp(504 bp-806bp)的完整開放閱讀框(OpenReading Frame，ORF)，編碼100個氨基酸。前期我們對

3、TDRG1基因在人多種組織中的表達進行RT-PCR分析，發(fā)現該基因僅在正常青春期及成年男性睪丸中高表達，而在其他組織中無明顯表達，表明它是一個在人睪丸組織中特異表達的基因，提示它可能與睪丸的功能有關系。同時我們利用半定量RT-PCR法分析TDRG1基因在人類睪丸不同發(fā)育階段的表達，發(fā)現TDRG1在4個月和6個月的胎兒睪丸中無表達，在15歲少年睪丸中強表達，在33歲青年睪丸中表達稍減弱，而在74歲老年男性睪丸組織中的表達明顯減弱，進一步提

4、示TDRG1與生精功能以及男性性成熟有關。
　　 為了明確TDRG1的功能，我們進行了深入的研究。本課題獲得國家自然科學基金資助(項目編號30672090)，課題由以下五部分組成。
　　 第一章人睪丸基因TDRG1在不同物種間同源序列的分析。
　　 目的：克隆人類睪丸特異基因TDRG1在不同物種間的同源序列，為研究該基因功能尋找動物模型。
　　 方法：以人TDRG1基因全長序列作為查詢序列，利用BLAST

5、N軟件檢索小鼠、大鼠和黑猩猩基因組數據庫。RT-PCR和免疫組化染色初探TDRG1在不同物種間同源基因的表達。
　　 結果：生物信息學分析表明小鼠和大鼠基因組中未檢索到與TDRG1同源的序列，而黑猩猩基因組中有相似性為98％的同源序列存在。RT-PCR和免疫組化染色檢測結果也表明小鼠和大鼠睪丸中無同源序列和同源蛋白表達。
　　 結論：TDRG1基因在小鼠和大鼠睪丸中無同源基因及蛋白表達，而在黑猩猩睪丸中有同源序列存在，為

6、今后建立動物模型提供了理論依據。
　　 第二章人睪丸特異基因TDRG1單克隆抗體的制備及鑒定。
　　 目的：構建原核質粒表達TDRG1重組蛋白，免疫小鼠制備單克隆抗體(mAb)，并鑒定其生物學特性；
　　 方法：用逆轉錄聚合酶鏈反應法從成人睪丸組織中擴增TDRG1編碼序列，將其克隆到pET21原核表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)內進行誘導表達TDRG1重組蛋白。以純化后的重組蛋白免疫BALB/C小鼠，利用雜

7、交瘤細胞融合技術制備抗TDRG1的mAb。用Western Blot法和免疫組化染色法鑒定mAb的特異性，用間接ELISA法檢測mAb腹水效價；
　　 結果：成功構建了pET21/TDRG1原核表達質粒，得到了純度較高的重組蛋白。免疫小鼠后獲得了2株能穩(wěn)定分泌抗TDRG1的mAb雜交瘤細胞系，WB結果顯示該單克隆抗體特異識別TDRG1和睪丸組織提取裂解液，免疫組化結果顯示該蛋白定位于睪丸各級生精細胞胞漿，腹水mAb效價高達1:1

8、.6×106；
　　 結論：所獲得的重組TDRG1蛋白純度高，免疫抗原性強，成功制備了抗TDRG1的mAb，為進一步研究TDRG1基因功能奠定了基礎。
　　 第三章 TDRG1蛋白在多組織中的表達分析及功能初探。
　　 目的：從蛋白質水平驗證TDRG1在人睪丸組織中的表達，探討TDRG1蛋白在人不同組織以及不同發(fā)育階段睪丸組織中的表達情況，初步探明TDRG1蛋白的功能；
　　 方法：使用免疫組化染色法確定

9、TDRG1蛋白在人睪丸組織中的表達，免疫組化染色確定TDRG1蛋白在人多種組織中的表達情況，Real-time PCR和免疫組化染色確定TDRG1在人不同發(fā)育階段睪丸組織中的表達水平；
　　 結果：TDRG1蛋白特異地表達于人睪丸組織，在心、肝臟、脾臟、胃、結腸、直腸、食道等正常組織中無表達。免疫組化染色顯示TDRG1蛋白的表達定位于人睪丸的曲細精管中，在生精細胞上有明確的陽性表達，而在基底膜和精子細胞中未見明顯表達；免疫組化染

10、色顯示了TDRG1蛋白在成人睪丸組織中高表達，在老年睪丸組織中表達減弱。Real-time PCR結果亦顯示TDRG1基因在成年人睪丸中高表達，而在老年人睪丸組織中表達減弱，在胎兒睪丸中表達極低；
　　 結論：本研究從蛋白質水平驗證了TDRG1基因在睪丸組織中的表達，TDRG1為睪丸特異表達蛋白，表達于人生精細胞，參與精子的生成。
　　 第四章 TDRG1蛋白在睪丸腫瘤發(fā)生中的作用。
　　 目的：探討人睪丸基因T

11、DRG1在睪丸腫瘤組織中的蛋白表達及其臨床病理學意義；
　　 方法：運用組織芯片技術、免疫組化法檢測人睪丸特異基因TDRG1在睪丸腫瘤組織和正常睪丸組織中的表達；
　　 結果：TDRG1蛋白在精原細胞瘤和睪丸畸胎瘤中的表達較正常人睪丸對照組顯著降低(P<0.05)，而在睪丸胚胎癌、睪丸卵黃囊瘤、睪丸結核和睪丸萎縮組織中的表達較正常人睪丸對照組降低，統(tǒng)計學分析無顯著性差異(P>0.05)；
　　 結論：TDRG1蛋

12、白的表達降低與睪丸腫瘤的發(fā)生明顯相關，推測TDRG1蛋白的功能可能與抑制某些類型的睪丸腫瘤發(fā)生相關，TDRG1可能是候選的抑癌基因。
　　 第五章人睪丸基因TDRG1重組真核載體的構建及其表達。
　　 目的：構建人睪丸基因TDRG1的真核表達質粒，并研究其表達；
　　 方法：取人新鮮正常睪丸組織，提取總RNA，采用逆轉錄.聚合酶聯鏈反應(RT-PCR)擴增TDRG1基因編碼序列；將該基因克隆到真核表達載體pYD5

13、中，構建真核細胞表達載體pYD5-TDRG1，用限制性內切酶酶切分析及DNA序列分析鑒定重組質粒；將測序正確的重組質粒pYD5-TDRG1在脂質體介導下轉染293細胞，間接免疫熒光法和Western Blot法鑒定目的蛋白質的表達；
　　 結果：RT-PCR擴增出TDRG1基因編碼序列，目的插入片段長約303bp；產物行限制性內切酶酶切后連接到真核表達載體pYD5，重組質粒pYD5-TDRG1經酶切及DNA測序鑒定構建成功；該質