睪丸組織高表達基因fancd2os的細胞特異性分析及初步功能研究.pdf

1、研究目的：
　　在課題組前期研究的基礎上，利用實時定量PCR（Real-time PCR）和蛋白印跡技術（Western blotting）從mRNA和蛋白水平分析fancd2os基因在睪丸組織不同細胞系中的表達譜；通過免疫組織化學和免疫熒光染色分析 FANCD2OS蛋白在睪丸組織中的細胞定位；并進一步建立過表達fancd2os基因的HEK293T細胞模型，從細胞水平深入探討fancd2os基因的潛在功能。
　　研究方法：<

2、br>　　1.通過實時定量PCR分析fancd2os mRNA在精原細胞（GC1-spg）、精母細胞（GC2-spd）、睪丸 Leydig間質(zhì)細胞（TM3）、睪丸 Sertoli支持細胞（TM4）四種細胞系中的表達；
　　2.運用Western blotting方法檢測FANCD2OS蛋白在GC1-spg、GC2-spd、TM3、TM4四種細胞系的表達；
　　3.利用免疫組織化學和免疫熒光染色分析FANCD2OS蛋白在睪丸組

3、織中的細胞定位；
　　4.建立fancd2os基因過表達的HEK293T細胞模型，分別利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）及Western blotting檢測fancd2os基因的過表達情況；
　　5.采用CCK8方法檢測過表達fancd2os基因?qū)EK293T細胞增殖能力的影響；
　　6.利用Western blotting檢測過表達fancd2os基因后HEK293T細胞Caspase3蛋白的水平；
　

4、　7.運用 Caspase3熒光染色試劑盒對紫外誘導后 HEK293T細胞凋亡狀況進行分析；
　　8.運用流式細胞術檢測過表達fancd2os基因?qū)ψ贤庹T導HEK293T細胞凋亡、線粒體膜電位水平的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.實時定量PCR結(jié)果顯示fancd2os mRNA在四種細胞系中均有表達，但是在TM3中的表達水平相對較高；
　　2. Western blotting結(jié)果顯示FANCD2OS蛋白在四種細

5、胞中都有表達，在TM3中的表達水平相對較高；
　　3.免疫組織化學和免疫熒光染色均發(fā)現(xiàn)FANCD2OS蛋白主要定位在睪丸間質(zhì)細胞中；
　　4. RT-PCR和Western blotting分析顯示在HEK293T細胞模型中檢測到fancd2os基因的過表達；
　　5. CCK8結(jié)果表明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HEK293T細胞增殖能力明顯高于空載體組和裸細胞組（p<0.05）;
　　6. Western blotting

6、結(jié)果顯示過表達組活化型Caspase3含量明顯高于其余兩組；
　　7.熒光染色實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組的Caspase3熒光陽性信號明顯多于空載體組和對照組；
　　8.流式細胞術分析表明過表達組的細胞凋亡程度明顯高于空載體組和裸細胞組（p<0.01），線粒體膜電位下降的百分比明顯高于空載體組和裸細胞組（p<0.05）。
　　研究結(jié)論：
　　1. fancd2os基因在GC1-spg、GC2-spd、TM3、TM4四種細胞系