大鼠睪丸特異表達(dá)基因Ube1的分離鑒定及生物學(xué)特征研究.pdf

1、精子發(fā)生是一個十分復(fù)雜但又高度有序的細(xì)胞分化過程，是相關(guān)基因嚴(yán)格受時空調(diào)控相繼轉(zhuǎn)錄表達(dá)的結(jié)果。生精細(xì)胞的發(fā)生分多階段進(jìn)行，曲細(xì)精管截面上不僅可以看到處于精子發(fā)生過程不同階段的各種生精細(xì)胞的組合，還可以看到支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等其它類型的細(xì)胞。它們分別具有自己的基因時空表達(dá)規(guī)律，但是此過程中的分子機(jī)制尚未完全闡明。因此分離得到單一的生精細(xì)胞群并建立單一細(xì)胞類型的cDNA文庫，就可以特異性地研究單一細(xì)胞的基因表達(dá)和有效地篩選不同生精細(xì)胞群之間

2、差異表達(dá)的基因。本研究采用牛血清白蛋白的梯度沉降法分離高純度生精細(xì)胞，并通過抑制性消減雜交(Suppressive Subtractive Hybridization，SSH)技術(shù)，構(gòu)建了A型精原細(xì)胞和粗線期精母細(xì)胞的雙向消減cDNA文庫，并對篩選出來的部分已知和未知基因進(jìn)行深入探索。 根據(jù)SSH的結(jié)果，我們從A型精原細(xì)胞和粗線期精母細(xì)胞的雙向消減cDNA消減文庫中選擇了576個PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)雜交(Dot Blottin

3、g)分析，以驗(yàn)證差異表達(dá)并分析其表達(dá)差異的強(qiáng)度。結(jié)果得到480個克隆在兩種細(xì)胞之間表達(dá)差異相差大于2倍。隨后我們選取40個存在明顯表達(dá)差異的克隆進(jìn)行測序分析，共產(chǎn)生了37個質(zhì)量滿意的ESTs序列，總測序成功率達(dá)到92.50％。 將這些EST分為已知基因、已知EST和全新EST三類。由于不同組織中基因的表達(dá)水平不同及cDNA文庫構(gòu)建所產(chǎn)生的冗余性，結(jié)果從大鼠A型精原細(xì)胞和粗線期精母細(xì)胞雙向消減cDNA文庫中得到的已知基因、已知ES

4、T和全新EST分別為89.19％、5.40％和5.40％。對代表已知基因的ESTs按照功能分類，發(fā)現(xiàn)主要涉及細(xì)胞凋亡、信號傳導(dǎo)和細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞結(jié)構(gòu)/運(yùn)動、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、代謝、線粒體基因幾類，并初步探討了大鼠精子發(fā)生過程中差異表達(dá)基因的作用和意義。 將大鼠精原細(xì)胞特異表達(dá)的克隆編號為P5810的EST序列進(jìn)行RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技術(shù)擴(kuò)增，獲得一個新的cDNA序列，命名為大鼠

5、泛素激活酶基因(Rattus norvegicus Ubiquitin-Activating Enzyme E1，Ubel)。在我們發(fā)現(xiàn)大鼠Ubel之前，GenBank庫中沒有大鼠Ubel的報(bào)道，我們第一次克隆了大鼠的Ubel基因的全長，登錄GenBank，獲得登錄號為EF690356。該基因序列全長3433bp，其中開放閱讀框有3171bp，編碼一個含1057個氨基酸的蛋白質(zhì)。預(yù)測其編碼蛋白分子量為11.78kD，等電點(diǎn)5.32。Bl

6、ast比對顯示，Ube1基因與小鼠泛素激活酶基因(Ube1yl)的同源性為92％，與人泛素激活酶基因(UBE1)的同源性為83％。Ube1基因編碼的蛋白質(zhì)包含了泛素激活酶信號位點(diǎn)和泛素激活酶活化位點(diǎn)，分別位于410-418aa和629-637aa，它們均存在于人類和小鼠的泛素激活酶中。 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription Polymerase Chain Reacion,RT-PCR)結(jié)果顯示，Ub