PGAM1表達與睪丸生精功能的關(guān)系及其生物學功能研究.pdf

1、目的：
　　1.探討PGAM1在人不同類型睪丸組織中的表達及其臨床意義。
　　2.探討PGAM1在生精功能不良動物模型中的表達及其意義。
　　3.探討PGAM1的生物學功能及相關(guān)作用機制。
　　方法：
　　1.收集40例不同組織學類型的睪丸組織（生精功能正常10例，輕度生精功能不良10例，重度生精功能不良10例，唯支持細胞綜合征10例），經(jīng)固定、脫水制成石蠟組織塊，采用免疫組化檢測PGAM1在不同組織學類型

2、睪丸組織中的表達情況，并分析PGAM1表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　2.收集8例不同組織學類型的新鮮睪丸組織標本（生精功能正常2例，輕度生精功能不良2例，重度生精功能不良2例，唯支持細胞綜合征2例），經(jīng)組織研磨提取RNA，采用qRT-PCR定量檢測PGAMmRNA表達水平，并分析其表達與臨床病理特征的關(guān)系。
　　3.挑選10只6W大的C57雄性小鼠，體重約為19～21g，隨機分為實驗組及對照組。其中，實驗組采用白消安(30

3、 mg/kg)及二甲基亞砜(DMSO)進行腹腔單次注射，構(gòu)建生精功能不良的C57動物模型，對照組僅注射等體積的DMSO。注射后2w，全部處死小鼠，收集小鼠睪丸組織。睪丸組織經(jīng)脫水、包埋做成石蠟組織。石蠟組織經(jīng)切片、脫水及脫蠟后行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察睪丸組織的形態(tài)學改變。同時，通過qRT-PCR及Western blot檢測實驗組及對照組睪丸組織中PGAM1的表達情況，分析睪丸生精功能與PGAM1表達的關(guān)系。
　　4.首先

4、通過qRT-PCR檢測PGAM1 mRNA在小鼠精原細胞株GC1、小鼠精母細胞株GC2及支持細胞株TM4中的表達水平，然后通過siRNA干擾技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染敲低GC1及TM4中PGAM1 mRNA的表達水平，并通過qRT-PCR及Westernblot進行驗證。
　　5，通過MTT實驗分別檢測PGAM1表達下調(diào)對GC1及TM4細胞增殖能力的影響;通過流式細胞儀分別檢測PGAM1表達下調(diào)對GC1及TM4細胞凋亡的影響;通過劃痕實驗分別檢

5、測PGAM1表達下調(diào)對GC1及TM4細胞運動能力的影響。
　　6.采用免疫組化及Western blot檢測PGAM1表達下調(diào)后下游凋亡相關(guān)蛋白Caspase6及caspase9、抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，初步探討PGAM1的分子機制。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化檢測PGAM1在不同組織學類型睪丸組織中的表達
　　免疫組化檢測結(jié)果表明PGAM1陽性表達于生精功能正常的睪丸組織，主要定位于精原細胞、精母細胞

6、及支持細胞的胞核及胞質(zhì)中，而精子細胞中無明顯陽性表達。其中，在40例不同類型睪丸組織中，PGAM1在生精功能正常、輕度生精功能不良、重度生精功能不良及唯支持細胞綜合征中的高表達率分別為90％(9/10)，80％(8/10)，10％(1/10)，100％(10/10)，組內(nèi)比較，差異具有明顯統(tǒng)計學意義(P=0.000)。然而，其表達與患者的年齡、睪丸體積、FSH、LH及T水平均無明顯相關(guān)(P＞0.05)。
　　2.qRT-PCR檢測

7、PGAM1在不同類型睪丸組織中的表達
　　為進一步探討PGAM1表達與睪丸生精功能的關(guān)系，我們通過qRT-PCR定量檢測了PGAM1在生精功能正常、輕度生精功能不良、重度生精功能不良及唯支持細胞綜合征睪丸組織中的表達水平，結(jié)果提示PGAM1 mRNA水平在生精功能正常睪丸組織中的表達明顯高于重度生精不良，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。結(jié)果也顯示PGAM1mRNA水平與患者的年齡、睪丸體積、FSH、LH及T水平均無明顯相關(guān)(

8、P＞0.05)。
　　3.PGAM1在生精功能不良動物模型中的表達
　　為驗證白消安單次腹腔注射后，是否能影響睪丸的生精功能，我們通過HE染色觀察了實驗組與對照組睪丸的形態(tài)學改變。結(jié)果所示，對照組睪丸組織中的生精小管結(jié)構(gòu)清晰，生精小管內(nèi)生精細胞的排列及層次整齊，可見到大量成熟的精子集中于生精小管的中間管腔，提示DMSO注射并沒有影響睪丸的生精功能;與對照組相比，我們發(fā)現(xiàn)在經(jīng)白消安注射后的實驗組小鼠睪丸組織中，生精小管發(fā)生明顯

9、的變形，并出現(xiàn)萎縮，生精小管內(nèi)生精細胞排列紊亂，各級生精細胞（精原細胞、精母細胞、精子細胞及精子）均明顯減少，提示經(jīng)白消安注射后睪丸組織出現(xiàn)了明顯的生精功能不良，睪丸生精功能不良的小鼠動物模型構(gòu)建成功。
　　隨后，我們通過免疫組化檢測了PGAM1的表達情況，結(jié)果顯示PGAM1在生精功能正常的睪丸組織中陽性表達于生精小管中的精原細胞、精母細胞、精子細胞及支持細胞的胞核及胞漿，同時也陽性表達于間質(zhì)細胞的胞核及胞漿。然而，PGAM1在生

10、精功能低下的睪丸生精小管中的表達明顯減弱。qRT-PCR定量檢測結(jié)果顯示PGAM1在生精功能不良的睪丸組織中的表達明顯低于對照組生精功能正常的睪丸組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同時，Western blot定量檢測結(jié)果也顯示PGAM1在生精功能不良的睪丸組織中的表達明顯低于對照組生精功能正常的睪丸組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.PGAM1表達下調(diào)對GC1及TM4生物學功能的影響
　　首先，我們

11、通過qRT-PCR定量檢測了PGAM1在小鼠精原細胞株(GC1)、小鼠精母細胞株(GC2)及小鼠支持細胞(TM4)中的表達情況，結(jié)果顯示PGAM1在GC1及TM4細胞株中的表達高于GC2。細胞免疫組化結(jié)果顯示PGAM1在GC1、GC2、TM4細胞株中表達主要定位于細胞質(zhì)，其中PGAM1在GC1及TM4細胞中的陽性表達強于GC2。同時，免疫熒光結(jié)果也表明PGAM1主要定位于細胞質(zhì)，PGAM1在GC1及TM4細胞中的陽性表達強于GC2細胞。

12、
　　隨后，為了進一步明確PGAM1的生物學功能，我們采用siRNA干擾技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染敲低PGAM1mRNA在GC1及TM4細胞株中的表達水平，依據(jù)qRT-PCR實驗篩選出干擾效果最佳的干擾片段進行后續(xù)實驗，并采用Western blot進行驗證。結(jié)果表明:針對PGAM1表達設(shè)計的三條干擾片段在GC1細胞中，下調(diào)PGAM1 mRNA的水平分別為24.7％、78.0％、32.0％。其中，與對照組相比，干擾片段2的干擾效果最佳，差異明顯

13、，具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。在TM4細胞中，三條干擾片段下調(diào)PGAM1mRNA的水平分別為11.0％、84.0％、31.3％。與對照組相比，干擾片段2的干擾效果也是最佳，差異明顯，具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。為此，我們選擇干擾片段2進行后續(xù)的研究。隨后，我們采用Western blot分別檢測了干擾片段2在GC1及TM4細胞中對PGAM1的干擾效果，結(jié)果顯示經(jīng)干擾片段2轉(zhuǎn)染后，PGAM1表達明顯下調(diào)。
　　為探討PG

14、AM1表達下調(diào)對GC1及TM4細胞增殖能力的影響，我們進行了MTT實驗。結(jié)果表明在GC1細胞中，PGAM1表達下調(diào)后細胞的生長曲線較平緩，OD值明顯較低，提示PGAM1表達下調(diào)后GC1細胞的增殖能力明顯減弱(P=0.000)。同時，在TM4細胞中，PGAM1表達下調(diào)后，細胞的生長曲線與對照組相比，也較平緩，OD值明顯低于對照組，提示PGAM1表達下調(diào)后TM4細胞的增殖能力明顯減弱(P=0.000)。
　　為探討PGAM1表達下調(diào)對

15、GC1及TM4細胞凋亡能力的影響，我們采用流式細胞儀檢測了細胞的凋亡率。結(jié)果顯示:對照組GC1細胞的凋亡為2.1％±0.5％，而PGAM1表達下調(diào)后GC1細胞的凋亡率為11.8％±1.5％，明顯高于對照組，差異明顯，具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。同時，對照組TM4細胞的凋亡為8.7％±2.4％，而PGAM1表達下調(diào)后GC1細胞的凋亡率為18.1％±3.9％，明顯高于對照組，差異明顯，具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　為探

16、討PGAM1表達下調(diào)對GC1及TM4細胞運動能力的影響，我們進行了劃痕實驗。結(jié)果表明PGAM1表達下調(diào)后24h，TM4細胞的遷移距離明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，提示PGAM1表達下調(diào)明顯抑制了TM4細胞的遷移。然而，PGAM1表達下調(diào)后24h，GC1細胞的遷移距離無明顯變化，差異無明顯統(tǒng)計學意義(P=0.786)，提示PGAM1表達下調(diào)明對GC1細胞的遷移能力無明顯影響。
　　5.PGAM1表達下調(diào)對下游

17、凋亡相關(guān)蛋白表達的影響
　　為探討PGAM1發(fā)揮生物學功能的潛在機制，我們通過Western blot檢測了PGAM1表達下調(diào)后，凋亡相關(guān)蛋白Caspase6及Caspase9的表達情況，同時也檢測了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達情況。結(jié)果表明，PGAM1表達下調(diào)后Caspase6及Caspase9表達均出現(xiàn)明顯上調(diào)，而Bcl-2表達出現(xiàn)明顯下調(diào)，提示PGAM1的表達下調(diào)激活了Caspases及Bcl-2信號通路。
　　結(jié)論：<