IgG4在腫瘤微環(huán)境中表達(dá)及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、目的：
　　免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig），是人體內(nèi)分泌最多、分布最廣的免疫活性分子。Ig是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的“Y”字形四肽結(jié)構(gòu)。按重鏈（u、γ、α、δ、ε）氨基酸的不同序列分為五大類型：IgM，IgG，IgA，IgD和 IgE。IgG（immunoglobulin G）,約占免疫球蛋白總量的75％-85%，在血液、組織液中分布廣泛，是體液免疫的重要組成部分。IgG4，是人體內(nèi)含量最少的IgG亞型，在正常

2、人體內(nèi)占總IgG含量不到5%。近幾年 IgG4由于 Fab段交換作用（Fab Arm Exchange，F(xiàn)AE）而備受關(guān)注，目前關(guān)于IgG4的研究主要集中在IgG4相關(guān)性疾?。↖gG4-related disease，IgG4-RD）、炎癥性疾病和自身免疫性疾病，極少涉及到惡性腫瘤。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) IgG4在食管癌組織中有顯著升高，隨后我們檢測(cè)了食管癌病人血清中IgG4的含量，也存在這一趨勢(shì)。為了探究腫瘤組織中以及血液循環(huán)中這種升高的趨

3、勢(shì)與臨床病理分期是否相關(guān)，腫瘤病人體內(nèi)的IgG4與正常人體內(nèi)的 IgG4含量的差異是否有意義，IgG4在腫瘤免疫微環(huán)境中究竟扮演什么樣角色。我們利用現(xiàn)有的資料和資源展開了一系列的實(shí)驗(yàn)。
　　方法：
　　75例腫瘤相關(guān)組織樣本來(lái)自于汕頭大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科和汕頭大學(xué)粵東地區(qū)病理會(huì)診中心，59例食管癌病人血液樣本來(lái)自于汕頭大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，26例健康人血液樣本來(lái)自于汕頭大學(xué)志愿者,實(shí)驗(yàn)樣本的收集和使用均已通過汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)

4、院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核、批準(zhǔn)。免疫組化和染色-脫色-再染色（stain destain restain，SDS）技術(shù)：利用SDS技術(shù)在同一張切片上完成 IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4等4種抗原在食管癌腫瘤組織上表達(dá)的檢測(cè)，經(jīng)過軟件處理后得到整合的圖像。免疫熒光雙重染色：在同一張組織切片上孵育兩種不同來(lái)源的抗體，在食管癌組織上檢測(cè)兩種不同的抗原，用紅綠兩種熒光顯示所檢測(cè)的抗原，藍(lán)色顯示細(xì)胞核。IgG的提?。喝〗】等思澳[瘤病人血漿

5、，利用rProteinG親和層析柱分離得到IgG。羅氏免疫比濁法檢測(cè)血清中IgG4及全I(xiàn)gG的含量：檢測(cè)收集的59例食管癌病人（病例組）和26例正常人（對(duì)照組）血清 IgG及 IgG4，計(jì)算 IgG4占總 IgG的比例，統(tǒng)計(jì)分析兩組間差異。木瓜蛋白酶酶切：IgG在半胱氨酸存在的條件下，木瓜蛋白酶在 IgG鉸鏈區(qū)以上的位置進(jìn)行切割，干燥箱37℃震蕩5小時(shí)，經(jīng)過Protein A純化，分離得到純Fab，F(xiàn)c段，離心濃縮測(cè)濃度，備用。蛋白質(zhì)B

6、iotin標(biāo)記法：將蛋白與活化液混合，加入DEMO和Biotin，室溫震蕩40分鐘。充分反應(yīng)后用除鹽柱將標(biāo)記好Biotin的蛋白質(zhì)純化，放4℃冰箱儲(chǔ)存，備用。將蛋白酶切得到的產(chǎn)物，經(jīng)過SDS-PAGE電泳，硝酸銀染色，鑒定 IgG、IgG亞型以及酶切后得到的各類IgG組分。蛋白質(zhì)免疫印跡：將標(biāo)記上 Biotin的 IgG4作為一抗，和轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜上的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgG1的Fab、Fc孵育，檢測(cè)蛋白之間的

7、反應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　在免疫組化中，食管癌病人腫瘤組織中 IgG4陽(yáng)性漿細(xì)胞數(shù)，比癌旁組織、正常組織多，并且IgG4的水平升高與病人的臨床病理分期有相關(guān)關(guān)系。免疫熒光雙重染色中，IgG4和 IgG1、IgG2、IgG3陽(yáng)性細(xì)胞不重疊，并且 IgG4陽(yáng)性細(xì)胞比例較高。SDS中， IgG4、IgG1、IgG2、IgG3在同一組織切片上染色，高倍鏡下同一視野內(nèi)， IgG4/IgGtotal相對(duì)比例較高。IgG4含量和IgG4的相

8、對(duì)水平（IgG4/IgGtotal）在食管癌病人血清中比正常人高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IgG4：P<0.0001；IgG4/IgG：P=0.003）。western blot中 Biotin標(biāo)記的 IgG4和 IgG四種亞型在50KD位置附近有反應(yīng)條帶；Biotin標(biāo)記的 IgG4 Fab片段和 IgG1的 Fab片段沒有反應(yīng)條帶，而與 IgG1的 Fc片段在30KD位置附近有反應(yīng)條帶。另外，IgG4的重鏈在50KD的附近位置有兩條不同大

9、小的條帶，并且IgG4的Fab片段在25KD的附近位置也有兩條大小不同的條帶。
　　結(jié)論：
　　在食管癌病人體內(nèi)IgG4含量及 IgG4/IgGtotal水平升高，并且 IgG4的升高與腫瘤病人的臨床病理分期有相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明 IgG4在免疫系統(tǒng)可能是免疫負(fù)調(diào)控的終產(chǎn)物，機(jī)體面對(duì)長(zhǎng)期存在的抗原無(wú)法有效清除而產(chǎn)生的一種妥協(xié)狀態(tài)。通過免疫組化、免疫熒光雙重染色、木瓜蛋白酶酶切、western blotting、ADCC等實(shí)驗(yàn)證明，

10、IgG4由漿細(xì)胞產(chǎn)生，四種IgG亞型由不同的漿細(xì)胞分泌，四種亞型之間不交叉， IgG4能夠和 IgG各亞型反應(yīng)， IgG4通過Fab段能夠和IgG1的Fc段發(fā)生反應(yīng)。據(jù)此，推測(cè)IgG4作為blocking antibody通過與腫瘤殺傷性性抗體 IgG1的 Fc段結(jié)合，從而干擾 IgG1與補(bǔ)體、FcR結(jié)合，下調(diào)IgG1介導(dǎo)的ADCC、ADCP作用。IgG4下調(diào)細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用這一機(jī)制為腫瘤的體液免疫也提供新的認(rèn)識(shí)，也為腫瘤的治療提供新