上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)Ig alpha重鏈及其生物學(xué)功能的研究.pdf

1、前期工作從中國(guó)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的基因組DNA文庫(kù)中克隆了一個(gè)具有細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化功能的基因Tx。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)Tx基因是一個(gè)缺乏可變區(qū)(V區(qū))的Ig kappa輕鏈基因。進(jìn)一步的EST數(shù)據(jù)庫(kù)分析提示，上皮性腫瘤細(xì)胞可能表達(dá)Ig kappa輕鏈。通過(guò)一系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)Ig kappa輕鏈的轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)。 在上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)Ig kappa輕鏈這一原創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中也存在Ig alp

2、ha重鏈蛋白的陽(yáng)性信號(hào)。這使繼Ig kappa輕鏈的研究之后，進(jìn)一步對(duì)Ig alpha重鏈在上皮性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的現(xiàn)象和功能等進(jìn)行深入而系統(tǒng)的研究，旨在為認(rèn)識(shí)上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)Ig這一異常現(xiàn)象及其潛在的生物學(xué)意義提供重要的理論依據(jù)。 1．利用生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)Ig alpha重鏈在多種腫瘤組織中的表達(dá) EST數(shù)據(jù)庫(kù)常被用于鑒定某一基因在哪些組織或細(xì)胞中表達(dá)。因此，首先將Ig alpha重鏈恒定區(qū)(C區(qū))基因進(jìn)行了EST

3、的搜索分析，發(fā)現(xiàn)大部分EST來(lái)源于B淋巴細(xì)胞，但有部分EST來(lái)源于肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、腎癌、宮頸癌等上皮性腫瘤組織或細(xì)胞。 進(jìn)一步，通過(guò)Virtual Northern Blot分析了Ig alpha重鏈的表達(dá)譜，結(jié)果表明Ig alpha重鏈表達(dá)于B淋巴細(xì)胞、肺癌、腎癌、前列腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、軟骨肉瘤、卵巢癌、鱗狀細(xì)胞癌等一系列上皮性腫瘤組織或細(xì)胞中。這現(xiàn)癌細(xì)胞表達(dá)Ig alpha 重鏈這一現(xiàn)象提了有力的佐證。

4、 2．確定上皮性腫瘤細(xì)胞系和組織表達(dá)Ig alpha重鏈 生物信息學(xué)的分析提供了初步的證據(jù)。進(jìn)一步，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)方法來(lái)證實(shí)上皮性腫瘤細(xì)胞能夠表達(dá)Ig alpha重鏈。考慮到Ig V，D，J區(qū)基因片段眾多，重組后的VDJ基因序列變異性較大，因此，首先分析了Ig保守的恒定區(qū)C區(qū)的表達(dá)。利用SW480(人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系)、MCF-7(人乳腺腺癌細(xì)胞系)、HeLa(人宮頸低分化鱗狀上皮癌)、MGC(人胃癌細(xì)胞系)、CNEl(人鼻咽癌

5、細(xì)胞系)五種上皮性腫瘤細(xì)胞系，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增Ig alpha重鏈恒定區(qū)(Cα區(qū))，并通過(guò)測(cè)序，結(jié)果證實(shí)了多種上皮性腫瘤細(xì)胞系中存在Ig alpha 重鏈CαmRNA基因的表達(dá)。 進(jìn)一步，采用質(zhì)譜分析從氨基酸水平證實(shí)Ig alpha蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。將CNEl全蛋白通過(guò)SDS-PAGE膠分離，切下50-60KD蛋白質(zhì)分子量范圍的膠條，利用質(zhì)譜分析蛋白的氨基酸序列。質(zhì)譜結(jié)果匹配到20種不同的蛋白，其中包含anti-col

6、orectal carcinoma Ig heavy chain protein,其匹配的氨基酸序列位于Ig重鏈V區(qū)。雖然沒(méi)有獲得Ig重鏈Cα區(qū)的直接信息，但I(xiàn)g重鏈V區(qū)的信息仍然Ig重鏈蛋白。 3.上皮性腫瘤細(xì)胞分泌Ig alpha重鏈蛋白 進(jìn)一步,通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),利用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的Ig alpha蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有五種上皮性腫瘤細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)上清中均存在分泌的Ig alpha重

7、鏈蛋白。同時(shí),收集HeLa細(xì)胞系無(wú)血清培養(yǎng)上清,通過(guò)Antibody分離純化試劑盒分離并純化Ig蛋白。將獲得的Ig蛋白通過(guò)SDS-PAGE膠電泳分離,麗春紅染色。結(jié)果顯示兩個(gè)條帶,一條約56KD,另一條約25KD。進(jìn)一步,通過(guò)Western Blotting分析這兩個(gè)條帶,證實(shí)一條含Ig alpha重鏈蛋白,另一條含Ig kappa輕鏈蛋白。從而確證了上皮性腫瘤細(xì)胞將Ig alpha重鏈蛋白和Ig kaooa輕鏈蛋白以結(jié)合體的形式分泌到

8、細(xì)胞外。 上述研究證實(shí)了lg alpha重鏈蛋白能被上皮性腫瘤細(xì)胞分泌出來(lái),而且不同上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞表達(dá)不同的Ig CDR3序列,且這些序列是B細(xì)胞中暫未發(fā)現(xiàn)的新序列,因此提示我們這種新的Ig分子有可能為上皮性腫瘤的血清學(xué)診斷提供一新的檢測(cè)指標(biāo)。 4.上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)Ig alpha重鏈的基因結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及重要的調(diào)控分子 B淋巴細(xì)胞表達(dá)Ig重鏈時(shí),Ig重鏈gDNA首先必須發(fā)生基因結(jié)構(gòu)變化,即Ig V,D,J基因片

9、段進(jìn)行重組形成VDJ連接,重組后的Ig重鏈才可能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。因此,分析了上皮性腫瘤細(xì)胞中Ig重鏈的gDNA基因結(jié)構(gòu)。以CNE1細(xì)胞作為代表,選擇V區(qū)和J區(qū)相對(duì)保守的三對(duì)conventional primers,通過(guò)nest-PCR對(duì)CNEl gDNA的Ig VDJ基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并通過(guò)測(cè)序,證實(shí)了CNEI細(xì)胞中Ig gDNA的V,D,J基因片段已經(jīng)發(fā)生了重組。因此,認(rèn)為上皮性腫瘤細(xì)胞中Ig gDNA基因已經(jīng)形成了VDJ重組結(jié)

10、構(gòu)。 通過(guò)研究上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)Ig alpha重鏈的基因結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)上皮性腫瘤細(xì)胞中同樣發(fā)生了Ig VDJ的基因重組。然而，與B細(xì)胞不同的是，上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)Ig alpha重鏈并不需要進(jìn)行CSR。可見(jiàn)，上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)Igalpha重鏈的機(jī)制與B細(xì)胞不完全相同。 5．上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)Ig alpha重鏈及其它Ig重鏈的腫瘤生物學(xué)意義 在分析了上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)并分泌Ig alpha重鏈及其重要的調(diào)控分

11、子之后，進(jìn)一步對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了研究。 首先通過(guò)shRNA Kit，以HeLa細(xì)胞為材料，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ig alphashRNA(通過(guò)與Ig Cα區(qū)結(jié)合抑制Ig alpha的表達(dá))的細(xì)胞系C αI，以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ig H shRNA(通過(guò)與Ig J區(qū)結(jié)合抑制所有Ig重鏈的表達(dá))的細(xì)胞系JI。通過(guò)RT-PCR證實(shí)了與原HeLa細(xì)胞相比，C α I細(xì)胞系中Ig alpha轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量非常低，而JI細(xì)胞系中Ig VDJ mRNA量

12、也幾乎無(wú)法檢測(cè)出。 以此為材料，通過(guò)生長(zhǎng)曲線分析，發(fā)現(xiàn)抑制上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)Igalpha．重鏈對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響；而抑制上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)的整個(gè)工g重鏈對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)存在較小的抑制作用。因此，認(rèn)為上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)的Ig alpha及其他Ig蛋白對(duì)上皮性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)作用較小。通過(guò)平板集落實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抑制上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)的Ig alpha重鏈對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖能力無(wú)顯著影響；而抑制上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)的整個(gè)Ig重鏈對(duì)

13、腫瘤細(xì)胞的增殖能力有一定的抑制作用。因此，認(rèn)為上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)的Igal pha對(duì)上皮性腫瘤細(xì)胞的增殖能力促進(jìn)作用較?。欢縄g蛋白對(duì)上皮性腫瘤細(xì)胞的增殖能力有一定的促進(jìn)作用。 6．上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)Ig alpha重鏈及其它Ig重鏈的免疫學(xué)功能 進(jìn)一步，對(duì)上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)Ig的免疫學(xué)功能進(jìn)行了探討。Ig的一個(gè)重要免疫學(xué)功能是介導(dǎo)ADCC效應(yīng)。根據(jù)前期研究結(jié)果提供的一些線索推測(cè)：癌細(xì)胞來(lái)源的Ig alpha重鏈其F

14、c段可以和單核／巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞表面的FcaR結(jié)合，而其Fab段由于不能和腫瘤細(xì)胞本身結(jié)合，從而不能有效介導(dǎo)ADCC殺傷效應(yīng)。因此，這種癌細(xì)胞分泌的Ig競(jìng)爭(zhēng)性抑制了效應(yīng)Ig介導(dǎo)的ADCC作用，從而可能使癌細(xì)胞得到了保護(hù)。發(fā)揮ADCC效應(yīng)的除了Ig alpha重鏈外，主要的是IgG分子，所以將研究拓展到全部癌Ig蛋白(包括IgA，IgG等)。 在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析癌細(xì)胞來(lái)源的Ig競(jìng)爭(zhēng)性抑制效應(yīng)Ig介導(dǎo)的ADCC作用。由于mou

15、se anti-human EGFR IgG2a的Fc段與人IgGl，IgG3的Fc段具有高度同源性，能夠與人單核／巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞的FcR高度親和，并且HeLa細(xì)胞表面表達(dá)EGFR蛋白，所以首先利用mouse anti-hLlman EGFR IgG2a建立人單核／巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞殺傷HeLa細(xì)胞的ADCC效應(yīng)系統(tǒng)。然后，利用CytoTox96 Non-RadiOaCtive Cytotoxicity Assay Kit，分析癌來(lái)

16、源的Ig蛋白競(jìng)爭(zhēng)性抑制moLlse ant i-human EGFR IgG2a介導(dǎo)的ADCC殺傷效應(yīng)。結(jié)果10μg／mlCa-IgG幾乎完全抑制了molise anti-human EGFR IgG2a(1μg／m1)介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)。因此，認(rèn)為ca-Ig可能通過(guò)其Fc段,競(jìng)爭(zhēng)性與殺傷細(xì)胞表面的Fcr結(jié)合,從而封閉了殺傷細(xì)胞表面的FcR，抑制了效應(yīng)Ig分子介導(dǎo)的ADCC殺傷腫瘤細(xì)胞腫瘤免疫效應(yīng)中，細(xì)胞免疫是很重要的方面。通過(guò)對(duì)上皮性

17、腫瘤細(xì)胞分泌Ig分子的免疫學(xué)功能的研究，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞來(lái)源的Ig能抑制效應(yīng)Ig分子介導(dǎo)的ADCC殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體細(xì)胞免疫提供了一個(gè)新的機(jī)制。同時(shí)將可能從免疫調(diào)控的角度為多種上皮性腫瘤的治療提供潛在的分子靶。 通過(guò)本課題的研究，對(duì)上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)免疫球蛋白這一現(xiàn)象有了新的科學(xué)發(fā)現(xiàn)，并為闡明腫瘤細(xì)胞表達(dá)Ig的病理生理學(xué)意義提供了有意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。這將從一個(gè)新的層面為了解腫瘤這一復(fù)雜性狀疾病提供新的啟示，