內(nèi)毒素對(duì)大鼠附睪特異基因Bin1b表達(dá)的影響、機(jī)制及生物學(xué)意義.pdf

1、附睪不僅是精子貯存和運(yùn)輸?shù)膱?chǎng)所,還參與了精子成熟的過程。由于B淋巴細(xì)胞的缺失,天然免疫在附睪防御系統(tǒng)中的地位顯得尤為重要。附睪中有這樣一類組織特異性表達(dá)的分子,它們具有防御素樣的三葉草結(jié)構(gòu)基序,又能夠與精子結(jié)合,執(zhí)行抗微生物入侵和促精子成熟的雙重功能。Bin1b(Spaglle)是中科院張永蓮院士實(shí)驗(yàn)室首先克隆并報(bào)道的附睪特異表達(dá)蛋白。該實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn),Bin1b基因編碼-條68個(gè)氨基酸的多肽,結(jié)構(gòu)上屬β防御素超家族成員。Bin1

2、b的表達(dá)具有嚴(yán)格的空間和時(shí)間特異性,它只表達(dá)于大鼠附睪頭部中段的上皮細(xì)胞中,性成熟時(shí)表達(dá)豐度最高。Bin1b能有效抑制附睪上皮原代培養(yǎng)上清液中E.coli的生長(zhǎng),還可在附睪不同區(qū)域以不同的方式與精子頭部結(jié)合,通過上調(diào)Ca2+誘導(dǎo)未成熟精子的前向運(yùn)動(dòng)。盡管目前對(duì)Bin1b生理功能的研究已有較大進(jìn)展,但是對(duì)病理狀態(tài)下的變化卻了解的不多。本文首次觀察了大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)對(duì)大鼠附睪頭部Bin1b和其它

3、12個(gè)附睪特異β防御素基因的表達(dá)的影響。在發(fā)現(xiàn)LPS能夠下調(diào)附睪中Bin1b和另一些β防御素表達(dá)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討了炎癥時(shí)Bin1b的表達(dá)減少與精子活力改變之間的關(guān)系,并在原代培養(yǎng)的大鼠附睪頭部上皮細(xì)胞中研究了參與介導(dǎo)Bin1b下調(diào)表達(dá)的可能因素,以闡明附睪炎癥條件下Bin1b基因的改變、機(jī)制和可能的病理意義。 一、LPS下調(diào)大鼠附睪頭部Bin1b和其它附睪頭部特異性β防御素的表達(dá) 采用單側(cè)附睪頭部直接注射LPS的方法

4、復(fù)制了大鼠附睪炎動(dòng)物模型,用注射等量生理鹽水的對(duì)側(cè)附睪作自身對(duì)照。H&E染色證實(shí),200μg LPS處理2天可以誘發(fā)單側(cè)附睪明顯的炎癥性改變,包括附睪管間隙增寬,間質(zhì)內(nèi)大量白細(xì)胞浸潤(rùn),以及毛細(xì)血管充血。Northern blot方法證實(shí)病變側(cè)附睪促炎細(xì)胞因子IL-1β mRNA的表達(dá)也呈LPS劑量和時(shí)間依賴性增加,表明附睪炎模型的復(fù)制是成功的。在此基礎(chǔ)上,我們采用Northern blot和Western blot的方法觀察了LPS處理

5、對(duì)附睪頭部組織中Bin1b表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),200μg LPS處理2天,可使Binlb mRNA和蛋白的表達(dá)水平減少90％以上(p<0.01)。為明確LPS導(dǎo)致的附睪Binlb下調(diào)是否也發(fā)生在其它附睪特異性β防御素家族成員中,我們又觀察了大鼠附睪頭部特異性表達(dá)的其它12個(gè)β防御素基因在LPS誘導(dǎo)的炎癥附睪中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS可以導(dǎo)致附睪頭部11個(gè)β防御素基因(Defb12,17,21,25,27,39,41,42,44,51和5

6、2)的表達(dá)明顯下調(diào)；只有1個(gè)成員(Defb29)的表達(dá)不受LPS調(diào)節(jié)。附睪特異性p防御素樣分子雖然是β防御素超家族中的成員,但是它們無論在功能(身兼抗微生物和促精子成熟的雙職)或是表達(dá)調(diào)控方面都具有-定的特殊性。與文獻(xiàn)所報(bào)道的在其它組織中β防御素往往受炎癥誘導(dǎo)性表達(dá)的模式不同,在附睪中LPS不是上調(diào),而是下調(diào)附睪中β防御素基因的表達(dá),提示它們?cè)诖倬映墒旆矫娴墓δ芸赡芨鼮橹匾?二、LPS減少大鼠附睪頭部Binlb表達(dá)是導(dǎo)致附睪

7、尾部精子活力下降的重要原因 Binlb能與附睪精子的頭部結(jié)合,幫助未成熟精子獲得前向運(yùn)動(dòng)能力。因此,我們推測(cè)附睪炎時(shí)Binlb的表達(dá)減少可能會(huì)引起精子運(yùn)動(dòng)能力的改變,從而導(dǎo)致附睪源性男性不育的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析(computer assisted sperm analysis,CASA)的方法,觀察LPS處理后附睪不同區(qū)域精子活力的改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)200μgLPS處理2天可明顯降低附睪體、尾部精子的總活力和前向運(yùn)動(dòng)率

8、。其中,附睪體部精子的總活力和前向運(yùn)動(dòng)率分別減少48.1％和55.8％(p<0.05);尾部精子總活力和前向運(yùn)動(dòng)率分別減少49.6％和57.1％(p<0.01)。為證明LPS引起的附睪精子活力下降和Binlb表達(dá)減少之間的關(guān)系,我們進(jìn)而將大鼠Binlb表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染附睪頭部上皮PCI細(xì)胞株獲得了含重組Binlb蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清,用其孵育LPS處理后的附睪尾部精子,結(jié)果顯示體外補(bǔ)充重組Binlb蛋白可使精子的總活力和前向運(yùn)動(dòng)率較LPS

9、處理后分別增加1.06倍和1.31倍(p<0.01)。免疫熒光化學(xué)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果與CASA結(jié)果相一致,LPS處理后精子頭部結(jié)合的Binlb量明顯減少,補(bǔ)充Binlb蛋白后,Binlb蛋白結(jié)合量又恢復(fù)至生理鹽水對(duì)照側(cè)水平,這進(jìn)一步證明在LPS引起的大鼠附睪炎中,Binlb的表達(dá)減少是導(dǎo)致精子活力下降的重要原因之一。 三、附睪頭部上皮細(xì)胞存在LPS受體,但是LPS不能直接下調(diào)上皮中Binlb的表達(dá) 以上我們證實(shí)了在體

10、LPS處理可導(dǎo)致大鼠附睪頭部組織中Binlb的表達(dá)下調(diào)。 但是下調(diào)的機(jī)制還不清楚,既可能是LPS直接作用于附睪上皮細(xì)胞,通過在該細(xì)胞中誘發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)Binlb的表達(dá)；也可能是在LPS導(dǎo)致的附睪炎癥反應(yīng)中,其他因素的改變對(duì)上皮細(xì)胞的間接作用。由于體內(nèi)參與炎癥的因素很多,內(nèi)環(huán)境復(fù)雜,為探討LPS導(dǎo)致Binlb下調(diào)的機(jī)制,我們?cè)蛛x并培養(yǎng)了大鼠附睪頭部上皮細(xì)胞,首先檢測(cè)了該細(xì)胞的LPS受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的反應(yīng)性,結(jié)果顯示,原

11、代培養(yǎng)的附睪頭部上皮細(xì)胞表達(dá)Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4),且LPS可使原代細(xì)胞中IL-1βmRNA的表達(dá)呈時(shí)間依賴性上調(diào),其中2001μg/ml LPS處理24小時(shí),IL-1βmRNA的表達(dá)增加至對(duì)照的8.27倍(p<0.01),表明LPS可通過上皮細(xì)胞中的自身受體和激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)下游靶基因的表達(dá)。我們繼而觀察了LPS對(duì)該細(xì)胞中Binlb表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與生理鹽水處理的對(duì)照細(xì)胞相比,

12、用不同濃度的LPS處理0-2天,原代細(xì)胞中Binlb的表達(dá)并沒有明顯改變,說明LPS在體內(nèi)下調(diào)Binlb的表達(dá),并不是通過與附睪上皮細(xì)胞的直接作用,而是一種間接的作用的結(jié)果。如LPS通過增加對(duì)Binlb表達(dá)具有抑制作用的因子,或者減少能促進(jìn)Binlb表達(dá)的因子導(dǎo)致該基因的下調(diào),這方面的研究有待于進(jìn)一步深入。 四、雄激素能上調(diào)原代培養(yǎng)的附睪頭部上皮細(xì)胞中Binlb的表達(dá),而雌激素和糖皮質(zhì)激素沒有調(diào)節(jié)作用 在原代培養(yǎng)的附睪頭

13、部上皮細(xì)胞中,我們還意外地發(fā)現(xiàn)Binlb mRNA的表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐步減少,培養(yǎng)5天后的附睪上皮細(xì)胞中幾乎測(cè)不到其表達(dá)。這提示可能在體內(nèi)某些未知的Binlb表達(dá)誘導(dǎo)因子在體外培養(yǎng)液中缺少或者濃度降低,從而不足以維持Binlb的表達(dá)。已知一些附睪蛋白的表達(dá)受甾體激素的調(diào)節(jié),因此我們觀察了不同濃度的雄激素-二氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT),雌激素-雌二醇(estradiol,E2)和糖皮質(zhì)激素-地塞米松(de

14、xamethasone,Dex)單獨(dú)作用對(duì)Binlb表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的DHT處理后,Binlb mRNA表達(dá)量較對(duì)照組均明顯增加(p<0.05),其中10-9M的DHT可使Binlb表達(dá)比對(duì)照細(xì)胞增加約30％,而E2或Dex處理的細(xì)胞Binlb mRNA的表達(dá)與對(duì)照相比沒有明顯的差別,這表明雄激素能上調(diào)Binlb的表達(dá),而雌激素或糖皮質(zhì)激素則無此作用。盡管雄激素有上調(diào)Binlb的作用,但是在體外雄激素單獨(dú)作用并不足以維持Bi

15、nlb在體內(nèi)的表達(dá)水平,提示體內(nèi)除了雄激素外,還存在其他能夠上調(diào)Binlb表達(dá)的因子,尋找這些調(diào)節(jié)因子是今后要開展的工作。 同樣的體外培養(yǎng)衰減表達(dá)模式也存在于附睪頭部特異β防御素Defb21中。巧合的是,Defb21在LPS處理后的附睪組織中的表達(dá)也呈時(shí)間和劑量依賴性下調(diào),而另-個(gè)附睪頭部特異β防御素Defb29在附睪組織的表達(dá)不受LPS調(diào)節(jié),在原代培養(yǎng)過程中其mRNA的表達(dá)量在所觀察的時(shí)間內(nèi)也不發(fā)生衰減。LPS導(dǎo)致的Binlb

16、表達(dá)下調(diào),是否有可能與維持其生理性表達(dá)的因子在炎癥時(shí)的水平下降有關(guān),值得進(jìn)一步研究。 綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)LPS可以抑制大鼠附睪頭部Binlb基因的表達(dá),使附睪精子與Binlb蛋白的結(jié)合減少,從而影響精子成熟過程,使附睪尾部精子運(yùn)動(dòng)能力降低。并且,LPS誘導(dǎo)的下調(diào)表達(dá)可能還是附睪特異表達(dá)的β防御素樣分子在炎癥時(shí)普遍存在的一種調(diào)節(jié)模式。附睪頭部上皮細(xì)胞表達(dá)TLR4受體,LPS刺激能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞中IL-1β mRNA的表達(dá),但LPS下

17、調(diào)組織中Binlb表達(dá)的主要機(jī)制并非通過與上皮細(xì)胞的直接作用。在原代培養(yǎng)的附睪頭部上皮細(xì)胞中,Binlb mRNA的表達(dá)呈時(shí)間依賴性減少,DHT對(duì)該細(xì)胞中Binlb的表達(dá)有一定上調(diào)作用,但并不能完全逆轉(zhuǎn)這種時(shí)間依賴性表達(dá)減少的趨勢(shì),E2或Dex單獨(dú)處理對(duì)該細(xì)胞中Binlb的表達(dá)沒有影響。以上發(fā)現(xiàn)將有助于更深入地了解β防御素樣附睪特異蛋白在炎癥和精子成熟過程中的病理生理作用,幫助闡明附睪炎與男性不育之間的關(guān)系,并可能為附睪源性男性不育和性