內(nèi)毒素對哮喘大鼠模型幾種哮喘相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、內(nèi)毒素(Endotoxin，ET)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分，由結(jié)構(gòu)易變的兩性分子即脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)組成，廣泛存在于室內(nèi)空氣和一些職業(yè)環(huán)境中。近五十年來，支氣管哮喘發(fā)病率迅速上升，已成為各國普遍關(guān)注的社會健康問題。現(xiàn)已明確環(huán)境因素和遺傳因素共同構(gòu)成其發(fā)病因素。流行病學(xué)研究表明內(nèi)毒素能引起哮喘發(fā)生和加重，但目前關(guān)于內(nèi)毒素的毒性研究主要集中在其引發(fā)的急性肺損傷(ALI)方面，關(guān)于闡述內(nèi)毒素對哮喘疾

2、患作用的研究甚少，討論其誘發(fā)和加重哮喘分子機(jī)制的報(bào)道更為罕見。
　　此外，作為一種空氣環(huán)境中普遍存在的毒物，內(nèi)毒素在生物體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化值得引起關(guān)注。CYP1A1是屬于細(xì)胞色素P450超家族的一類同工酶，在生物體內(nèi)廣泛參與內(nèi)源性和外源性毒物的轉(zhuǎn)化。大量研究表明環(huán)境中大多數(shù)致癌物都是CYP1A1的底物和誘導(dǎo)物，因此CYP1A1被認(rèn)為是癌癥的一個(gè)潛在指征。CYP1A1可受各種因素的影響而改變，如藥物、疾病、飲食、激素水平及各種化學(xué)物質(zhì)等

3、，然而關(guān)于內(nèi)毒素對CYP1A1的影響卻鮮見報(bào)道。
　　為了探討內(nèi)毒素對哮喘發(fā)生和加重作用的分子機(jī)理，為哮喘的預(yù)防和治療提供新的思路，以及研究內(nèi)毒素對CYP1A1的影響及其分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以LPS腹腔注射染毒技術(shù)處理實(shí)驗(yàn)動物及卵蛋白(OVA)誘發(fā)建立哮喘大鼠模型，以大鼠肺組織為研究材料，選擇TNF-α、IL-4、ICAM-1等多種因子為研究重點(diǎn)，采用實(shí)時(shí)定量PCR、ELISA、熒光分光光度法等方法，從以下三個(gè)方面進(jìn)行研究:(1)探討

4、0.05mg/kg LPS染毒對哮喘模型大鼠肺組織中TNF-α、IL-4、ICAM-1等哮喘AHR相關(guān)因子mRNA或蛋白表達(dá)的影響及其分子機(jī)制，并對大鼠肺組織進(jìn)行組織病理學(xué)分析;(2)觀察不同濃度(0.01、0.1、1mg/kg) LPS染毒對正常大鼠肺組織中上述幾種哮喘AHR相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響及其劑量-效應(yīng)關(guān)系，并對不同劑量染毒組大鼠肺組織進(jìn)行組織病理學(xué)分析;(3)研究不同劑量內(nèi)毒素暴露對大鼠肺組織CYP1A1mRNA表達(dá)及肺

5、微粒體中CYP1A1活性的影響及其作用機(jī)制。
　　1.LPS染毒對哮喘大鼠肺組織中TNF-α、IL-4、ICAM-1等哮喘AHR相關(guān)因子mRNA或蛋白表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果表明，LPS單獨(dú)暴露增加了大鼠肺組織TNF-a、IL-4和ICAM-1 mRNA表達(dá)水平，但均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。和對照組相比，OVA可顯著誘導(dǎo)大鼠氣肺組織中TNF-a、IL-4和ICAM-1 mRNA表達(dá)升高。LPS和OVA共同作用引起大鼠肺組織中

6、各基因mRNA表達(dá)顯著升高，較對照組和OVA處理組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)Elisa法檢驗(yàn)，LPS處理組、OVA處理組和OVA+LPS誘導(dǎo)組大鼠肺組織中TNF-a和IL-4蛋白表達(dá)水平較對照組均顯著升高，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中LPS和OVA共同作用時(shí)引起大鼠肺組織中TNF-a和IL-4蛋白表達(dá)水平較OVA單獨(dú)暴露時(shí)也有顯著增加（＃＃P＜0.01和＃P＜0.05）。
　　2.哮喘模型大鼠肺組織病理學(xué)觀察和免疫組化分析
　　病理學(xué)觀察

7、顯示，對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)、肺小血管及毛細(xì)血管形態(tài)基本正常，極少見炎性細(xì)胞浸潤，未見明顯的病理學(xué)變化。LPS處理組、OVA處理組及OVA+LPS誘導(dǎo)組大鼠肺組織較對照組均出現(xiàn)不同程度的病理變化，包括肺泡壁增厚、肺泡腔狹窄、炎性細(xì)胞大量浸潤，腔內(nèi)可見脫落的上皮細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，肺組織中的平滑肌和基底膜增生等。其中OVA+LPS誘導(dǎo)組大鼠肺組織病理變化較OVA處理組更為顯著。
　　3.不同濃度LPS染毒對大鼠肺組織中TNF-α

8、、IL-4、ICAM-1等哮喘AHR相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果顯示，不同濃度(0.01、0.1、1mg/kg) LPS對大鼠染毒后，隨著LPS染毒劑量的遞增，大鼠肺組織中TNF-a、IL-4、ICAM-1mRNA表達(dá)水平均依次升高，且在染毒劑量范圍內(nèi)，各基因mRNA的表達(dá)水平與LPS染毒劑量之間成正相關(guān)，0.1、1mg/kg的LPS染毒可引起三種基因mRNA表達(dá)水平較對照組顯著升高（有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。
　

9、　4.LPS劑量組大鼠肺組織病理學(xué)觀察和免疫組化分析
　　病理學(xué)觀察顯示，隨著LPS染毒劑量的增大，大鼠肺組織的病理學(xué)變化愈加明顯。0.01、0.1、1mg/kg組大鼠肺組織較對照組均出現(xiàn)不同程度的病理變化（具體特征與哮喘模型大鼠肺組織相似），病理學(xué)變化程度為1 mg/kg組＞0.1 mg/kg組＞0.01 mg/kg組。
　　5.不同濃度內(nèi)毒素對大鼠肺組織CYP1A1mRNA表達(dá)及微粒體中CYP1A1活性的影響
　　

10、結(jié)果表明，隨著LPS染毒濃度的增大，大鼠肺組織中CYP1A1mRNA表達(dá)水平和肺微粒體CYP1A1的活性均依次升高，在染毒范圍內(nèi)(0.01-1mg/kg)二者與LPS染毒濃度之間分別具有良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系(r＞0)，且當(dāng)染毒濃度為0.1 mg/kg和1mg/kg時(shí)，肺CYP1A1mRNA表達(dá)水平和肺微粒體CYP1A1的活性分別較對照組有顯著性差異?？傊?，在基因表達(dá)水平和酶活水平上，內(nèi)毒素對CYP1A1均產(chǎn)生了明顯的誘導(dǎo)作用，且兩方面具

11、有高度的一致性。
　　6.結(jié)論
　　綜上所述，內(nèi)毒素染毒可以誘導(dǎo)正常和哮喘大鼠肺組織TNF-α、IL-4、ICAM-1等哮喘AHR相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，并對大鼠肺組織形態(tài)具有重塑作用，從而誘發(fā)和加重哮喘疾病。此外，在低劑量范圍內(nèi)，大鼠肺組織中TNF-α、IL-4、ICAM-1等哮喘AHR相關(guān)基因表達(dá)水平和肺組織病理學(xué)改變程度均與內(nèi)毒素染毒濃度具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(r＞0)。另一方面，內(nèi)毒素以劑量依賴的方式顯著誘導(dǎo)了大鼠肺組織