牛珀至寶微丸對(duì)內(nèi)毒素休克相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響.pdf

1、1、研究目的: 牛珀至寶微丸臨床治療感染性休克療效顯著，一氧化氮(NO)及其相關(guān)基因在內(nèi)毒素休克中對(duì)血壓調(diào)節(jié)、臟器損傷與修復(fù)起重要作用。為探討牛珀至寶微丸治療感染性休克的機(jī)理是否與一氧化氮及其相關(guān)基因相關(guān)，本研究從整體水平、細(xì)胞、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因調(diào)控各個(gè)層次對(duì)牛珀至寶微丸調(diào)控一氧化氮及其相關(guān)基因進(jìn)行研究。 2、研究?jī)?nèi)容、方法: 本實(shí)驗(yàn)分在體實(shí)驗(yàn)與離體實(shí)驗(yàn)二部分。 整體實(shí)驗(yàn)主要觀察牛珀至寶微丸調(diào)控NO對(duì)內(nèi)毒素

2、休克血壓、臟器損傷及修復(fù)的影響。用靜脈注射脂多糖內(nèi)毒素(LPS)1.5mg/kg、腹腔注射D-氨基半乳糖(D-GaLN)100mg/kg 造成內(nèi)毒素休克模型，用牛珀至寶微丸和一氧化氮合酶抑制劑氨基胍(AG)作干預(yù)處理，用BL-410 生理儀監(jiān)測(cè)血壓，用OlympusAU2700型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行肝功能檢測(cè)，用HE染色觀察各臟器的病理形態(tài)，用硝酸還原酶法檢測(cè)血漿NO濃度，同位素標(biāo)記法測(cè)組織勻漿一氧化氮合酶(NOS)活性，免疫組化、We

3、sterrl blot 方法檢測(cè)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (iNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶 (eNOS)在各臟器組織內(nèi)的表達(dá)，用 Van Gieson 法染色檢測(cè)膠原纖維在肺組織內(nèi)的表達(dá)，免疫組化方法檢測(cè)肺組織高遷移蛋白 (HMGB<,1>)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (TGF-β<,1>)及其受體的表達(dá)，并用激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)一步觀察高遷移率族蛋白(HMGB<,1>)的表達(dá)。 離體實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因調(diào)控水平觀察牛珀至寶微丸動(dòng)物血清對(duì)L

4、PS刺激RAW264.7iNOS 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。用硝酸還原酶法檢測(cè)測(cè)定蛋白激酶C (PKC)抑制劑對(duì)LPS誘導(dǎo)的NO生成作用，用PKC活性測(cè)定法研究LPS對(duì)PKC的激活作用；用基因重組技術(shù)構(gòu)建iNOS 熒光素酶報(bào)告基因載體；用基因轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因檢測(cè)等方法研究牛珀至寶微丸調(diào)控LPS刺激RAW264.7細(xì)胞對(duì)iNOS啟動(dòng)子活性的誘導(dǎo)作用及其與PKC的關(guān)系，以明確牛珀至寶微丸對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞iNOS啟動(dòng)子活性的誘導(dǎo)作用及

5、PKC的影響。 3、研究結(jié)果: 牛珀至寶微丸對(duì)內(nèi)毒素休克與NO影響結(jié)果顯示：LPS注射即時(shí)血壓迅速下降成穩(wěn)定的低血壓，AG 有顯著的升壓作用，用藥 30min 后血壓上升接近正常水平，至240min甚至高于原基礎(chǔ)血壓；牛珀至寶微丸血壓回升穩(wěn)定而緩慢，AG+牛珀至寶微丸有升壓作用，但并未疊加，而是使升壓作用緩和。LPS組NO 濃度持續(xù)上升，AG可明顯使NO濃度下降迅速而且穩(wěn)定，注射后 30min即回復(fù)至正常水平，240mi

6、n 后仍有繼續(xù)下降趨勢(shì)。牛珀至寶微丸組NO緩慢上升，其上升幅度高于LPS組而低于正常組。提示牛珀至寶微丸可使內(nèi)毒素休克鼠血漿NO濃度緩慢下降，抑制NO的過(guò)量生成。AG+牛珀至寶微丸的作用疊加無(wú)顯著意義。iNOS蛋白活性檢測(cè)結(jié)果顯示：LPS可致iNOS活性顯著增強(qiáng)，AG可抑制iNOS，牛珀至寶微丸可抑制iNOS活性，AG+牛珀至寶微丸其作用有增強(qiáng)趨勢(shì)。iNOS Western Blotting 結(jié)果顯示：正常組iNOS條帶缺如，LPS組i

7、NOS強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，AG組iNOS表達(dá)較弱，牛珀至寶微丸iNOS表達(dá)也較弱，但不如AG組明顯，AG+牛珀至寶微丸其作用有增強(qiáng)趨勢(shì)。牛珀至寶微丸對(duì)內(nèi)毒素休克各臟器損傷的形態(tài)、功能影響與iNOS關(guān)系結(jié)果顯示：AG對(duì)內(nèi)毒素性肝損傷血清ALT、AST的濃度變化無(wú)影響，牛珀至寶微丸則可以明顯改善以上肝功能指標(biāo)及肝臟病理?yè)p壞，并能減少肝細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的iNOS表達(dá)。內(nèi)毒素休克心臟iNOS陽(yáng)性細(xì)胞分布于心臟外膜與心肌，牛珀至寶微丸能明顯降低

8、內(nèi)毒素所致iNOS表達(dá)，并能改善內(nèi)毒素休克的心臟損害。內(nèi)毒素休克腦iNOS陽(yáng)性細(xì)胞分布于大腦皮質(zhì)、紋狀體、腦干、小腦等，牛珀至寶微丸能明顯降低內(nèi)毒素腦iNOS表達(dá)，并能改善內(nèi)毒素休克腦損害。內(nèi)毒素休克腎組織iNOS表達(dá)增強(qiáng)，牛珀至寶微丸能明顯降低內(nèi)毒素腎iNOS表達(dá)，并能改善內(nèi)毒素休克腎損害。 牛珀至寶微丸對(duì)內(nèi)毒素休克臟器損傷修復(fù)與NOS表達(dá)關(guān)系結(jié)果顯示：牛珀至寶微丸降低肺組織iNOS活性，使肺內(nèi)iNOS表達(dá)減弱、而且同時(shí)能使e

9、NOS表達(dá)增強(qiáng)，肺損傷減輕。對(duì)內(nèi)毒素急性肺損傷的修復(fù)表明，內(nèi)毒素肺損傷肺組織膠原纖維染色顯著增強(qiáng)，牛珀至寶微丸能減輕肺損傷，并能減弱肺組織膠原纖維染色。內(nèi)毒素肺損傷與修復(fù)的相關(guān)因子結(jié)果顯示：牛珀至寶微丸可增強(qiáng)內(nèi)毒素休克晚期關(guān)鍵核因子高遷移蛋白(HMGB<,1>)的表達(dá)，增強(qiáng)肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β<,1>及其受體表達(dá)而不產(chǎn)生纖維化。 離體實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因調(diào)控水平研究結(jié)果顯示：牛珀至寶微丸可負(fù)調(diào)節(jié)LPS刺激RAW264.7細(xì)

10、胞引起的PKC磷酸化激活和膜移位，并可延長(zhǎng)PKC抑制劑H7下調(diào)NO作用時(shí)間。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，牛珀至寶微丸可抑制LPS刺激誘導(dǎo)的iNOS啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，并可增強(qiáng)H7和鈣離子通道阻滯劑維拉帕米的作用。牛珀至寶微丸抑制LPS刺激RAW264.7細(xì)胞所致的NO生成增加，其機(jī)制之一是量效與時(shí)間兩方面抑制PKC激活和細(xì)胞內(nèi)鈣增加，從而影響iNOS啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。 4、研究結(jié)論: AG 過(guò)快、無(wú)限制的升壓可能對(duì)機(jī)體不

11、利。牛珀至寶微丸治療內(nèi)毒素休克與NO途徑相關(guān)，但不同于單純的一氧化氮合酶抑制劑，升壓穩(wěn)定而緩慢，可能更有利于機(jī)體恢復(fù)，這也詵明牛珀至寶微丸有平穩(wěn)的升壓作用不只是單純的NO作用途徑，而且存在某種穩(wěn)定NO濃度的機(jī)制。牛珀至寶微丸治療內(nèi)毒素休克各臟器損傷與減少iNOS表達(dá)相關(guān)，與一氧化氮合酶抑制劑不同的是能使eNOS 表達(dá)增強(qiáng)；對(duì)于內(nèi)毒素?fù)p傷與修復(fù)表明，牛珀至寶微丸其機(jī)理可能與增強(qiáng)纖維化因子TGF-β<,1>及其受體表達(dá)相關(guān)，能增強(qiáng)內(nèi)毒素休克