PRRSV變異株的分離鑒定及生物學(xué)特性的研究.pdf

1、2006年6月以來，安徽省部分地區(qū)及周邊省市豬暴發(fā)了以發(fā)熱、厭食、眼結(jié)膜炎等為主要癥狀，以高熱、高發(fā)病率、高死亡率為主要特征的豬急性傳染病，即所謂的“豬高熱病”。通過血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)表明，發(fā)病豬多為雙重或三重以上感染，常見的混合感染病原為豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟、圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病、鏈球菌等。病因調(diào)查結(jié)果顯示，這次“豬高熱病”流行是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）變異株引起高致病性藍(lán)耳病。為追溯“豬高熱病”豬群中PRRS

2、V流行毒株的來源和變異原因，探索“豬高熱病”預(yù)防與控制措施，本研究對(duì)2007～2008年間分離的PRRSV流行毒株進(jìn)行了鑒定、主要基因序列測(cè)定、致病性試驗(yàn)，分析了我省PRRSV流行株與國內(nèi)外已發(fā)表的其它毒株間的遺傳變異關(guān)系。研究結(jié)果為探索我省“高熱病”豬群中PRRSV流行株的來源、分子流行病學(xué)和變異情況等提供科學(xué)依據(jù)，為“豬高熱病”的診斷和防制奠定理論基礎(chǔ)。
　　 1．將采自舒城、定遠(yuǎn)、肥西、宿州、黃山等縣市的不同豬場(chǎng)持續(xù)發(fā)熱的

3、60份發(fā)病豬的肺臟、脾和淋巴結(jié)等組織病料用RT-PCR進(jìn)行PRRSV檢測(cè)，篩選陽性樣品經(jīng)處理后接種到Marc-145細(xì)胞，能產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，電鏡觀察可見直徑50-80nm的有囊膜病毒粒子，與美洲型PRRSV陽性血清進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)可見特征性熒光；RT-PCR檢測(cè)可見目的條帶，證實(shí)分離的5株病毒為PRRSV，分別命名SCH07、DY07、FX07、SZH08、HSH08。
　　 2．對(duì)5株P(guān)RRSV的Nsp2高變區(qū)和ORF

4、5測(cè)定和序列分析結(jié)果表明，所有分離株的Nsp2都發(fā)生30個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失，缺失位置與JXA1株完全一致；5株流行株之間Nsp2基因高變區(qū)核苷酸同源性在97.1％～98.7％之間，ORF5全基因的核苷酸同源性在96.9％～99.7％之間。根據(jù)Nsp2基因高變區(qū)、ORF5全基因的核苷酸同源性，與2006年后的新分離株尤其是HuB1株同源性最高，核苷酸同源性分別在96.8％以上。根據(jù)Nsp2基因高變區(qū)、ORF5全基因所建立的遺傳系統(tǒng)發(fā)育樹

5、可知這5株P(guān)RRSV流行株之間的親緣關(guān)系很近，與江西、湖北等2省的PRRSV流行株由同一毒株演化而來，同屬美洲型。
　　 3．選取SCH07毒株的第15代細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)Reed-Muench法測(cè)定毒價(jià)為10-4.7 TCID50/0.1mL。按5mL/頭經(jīng)口、鼻接種PRRSV抗原與抗體均為陰性的健康豬2頭，并設(shè)陰性對(duì)照組。通過測(cè)量體溫、臨床癥狀、大體病變、病理切片觀察、RT-PCR、ELISA抗體檢測(cè)等方法分析其病毒致病性。結(jié)果表