貓杯狀病毒FB-NJ-13株的分離鑒定及生物學(xué)特性研究.pdf

1、貓杯狀病毒(Feline calicivirus，F(xiàn)CV)可引發(fā)貓科動(dòng)物的上呼吸道疾病、口腔水皰性疾病以及慢性胃腸炎等疾病，臨床癥狀表現(xiàn)為口腔潰瘍、鼻炎、結(jié)膜炎、慢性胃腸炎、急性關(guān)節(jié)炎等，還會(huì)導(dǎo)致肺臟、脾臟和胰臟等損傷，嚴(yán)重的可導(dǎo)致動(dòng)物死亡。FCV僅有1個(gè)血清型，基因組由3個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼，基因表現(xiàn)多樣性。FCV呈世界性分布，且已在一些國(guó)家和地區(qū)的珍稀貓科野生動(dòng)物中分離到了FCV，我國(guó)獵豹和虎之間也有流行的報(bào)道，給寵物和野生動(dòng)物的生存帶

2、來(lái)了威脅。因此，進(jìn)行FCV的分離鑒定以及生物學(xué)特性的研究可為FCV的流行病學(xué)研究、疾病防控和基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供重要的科學(xué)依據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)將疑似感染FCV的貓鼻咽拭子接種于敏感細(xì)胞CRFK，盲傳至第3代時(shí)CRFK細(xì)胞可出現(xiàn)圓縮、脫落等特征性的病變。對(duì)分離株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)可以擴(kuò)增到目的條帶，命名為FB-NJ-13; Eva Green實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法能夠檢測(cè)到分離株病毒拷貝數(shù)為2.03×106copies/uL;電

3、鏡下觀察到病毒粒子呈圓球形，沒(méi)有囊膜，大小在35～39nm之間，符合FCV的形態(tài)學(xué)特征;間接免疫熒光試驗(yàn)表明分離株可與FCV陽(yáng)性血清反應(yīng)，在熒光顯微鏡下能夠看到綠色熒光;測(cè)定分離株的病毒滴度為108 TCID50/mL;對(duì)分離株進(jìn)行噬斑純化，獲得了純化的病毒株。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GenBank中收錄的FCV全基因組序列，設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，對(duì)分離株進(jìn)行全基因組測(cè)序，結(jié)果表明FB-NJ-13全長(zhǎng)7684 bp，并將序列提交至GenBank，登錄號(hào)為K

4、M111557。
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)FB-NJ-13分離株的理化特性、細(xì)胞致病性、全基因組序列和遺傳演化分析以及小鼠致病性等生物學(xué)特性進(jìn)行研究。溫度、酸堿、有機(jī)溶劑及干燥和紫外照射等理化特性研究表明，F(xiàn)B-NJ-13株在50℃30 min或70℃5 min可被滅活;在pH3.0和pH10.0以上的環(huán)境中不穩(wěn)定;對(duì)氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑不敏感;經(jīng)相同時(shí)間處理，紫外照射比干燥處理的殺傷作用強(qiáng)。細(xì)胞致病性試驗(yàn)顯示FB-NJ-13對(duì)CRFK細(xì)胞、

5、Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞具有致病性，對(duì)DFI細(xì)胞、PK15細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞等無(wú)致病性。全基因核苷酸序列分析結(jié)果顯示，F(xiàn)B-NJ-13與其他33株參考毒株的同源性為76.2％～79.5％，與GD株的同源性最高(79.5％)。分析分離株ORF1、ORF2及ORF3氨基酸序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)知，ORF3氨基酸序列相對(duì)保守（82.2％～86.9％），ORF1、ORF2和ORF3均與GD株處于較近的分支上，推測(cè)FB-NJ-13與GD親緣關(guān)系最