狐貍源偽狂犬病毒HB1株的分離鑒定及生物學(xué)特性分析.pdf

1、偽狂犬病(pseudorabies，PR)是偽狂犬病毒引起的多種家畜和野生動(dòng)物的一種急性傳染病。偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)屬皰疹病毒科水痘病毒屬豬皰疹病毒Ⅰ型。PRV的宿主感染譜非常廣泛，能感染絕大多數(shù)的哺乳動(dòng)物，包括豬、牛、羊、狗、貓、兔、狐貍、水貂和貉等動(dòng)物。2011年以來(lái)，PRV變異毒株在中國(guó)中東部地區(qū)廣泛流行，給養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了非常大的影響。PRV是影響狐貍養(yǎng)殖業(yè)的重要的病毒性病原之一，狐貍P

2、R的主要臨床癥狀為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和呼吸道癥狀。目前暫無(wú)狐貍專用的PRV疫苗，其防控形勢(shì)嚴(yán)峻。本研究從發(fā)生PR的狐貍場(chǎng)，分離鑒定狐貍源PRV流行毒株，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性的研究，揭示了狐貍PR的發(fā)生和流行特征，為其有效的防控奠定基礎(chǔ)。
　　本研究從河北地區(qū)采集到疑似感染PRV死亡狐貍病料，組織病料經(jīng)研磨處理后，提取組織的病毒DNA，進(jìn)行PRV的PCR檢測(cè)，PCR結(jié)果為PRV陽(yáng)性。將病料接種PK15細(xì)胞傳代培養(yǎng)，PK15細(xì)胞出現(xiàn)典型的P

3、RV CPE變化。通過(guò)噬斑純化，獲得了狐貍源PRV分離株純化病毒。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明，該P(yáng)RV分離株可與PRV Bartha K-61株和PRV HeN1株的陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，產(chǎn)生特異性熒光，將該分離株命名為PRVHB1株。HB1株的的透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，病毒近似圓球形，直徑約為150-180 nm，符合皰疹病毒粒子的形態(tài)。
　　HB1株可感染PK15等12種細(xì)胞，但在不同細(xì)胞的CPE變化和增殖特性不同，以微量

4、法測(cè)得HB1株在PK15細(xì)胞上的滴度為10767TCID50/mL。一步生長(zhǎng)曲線表明，HB1株與Bartha K-61株和SC株具有相似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，且HB1株在PK15細(xì)胞上的滴度最高。中和試驗(yàn)結(jié)果表明，Bartha K-61陽(yáng)性血清和HeN1陽(yáng)性血清能夠中和HB1株的最高稀釋度分別為8倍和32倍，HeN1變異株的抗血清能夠完全中和HB1株，而B(niǎo)artha K-61疫苗株的抗血清不能完全中和HB1株。以96對(duì)引物對(duì)HB1株進(jìn)行基因組的

5、分段測(cè)序，最終共得到HB1株的52個(gè)基因的序列，遺傳演化分析表明，HB1株屬于PRV基因Ⅱ型，HB1 gE基因與Becker和Kaplan株的同源性為97.9％，與HBCL和TJ等國(guó)內(nèi)分離株的同源性均達(dá)到99％以上;與歐美等國(guó)外參考毒株相比，HB1株gE基因編碼的氨基酸序列共存在19個(gè)替換和2個(gè)插入。HB1 gC基因與Bartha、Becker、Kaplan和SC株的同源性為96.2％，與HBCL、HLJ8和JS-2012等國(guó)內(nèi)變異株的

6、同源性均達(dá)到99.5％以上;與歐美等國(guó)外參考毒株相比，HB1 gC基因編碼的氨基酸序列共存在27個(gè)替換，及在第63-69位存在一個(gè)AAASTPA的連續(xù)7個(gè)氨基酸插入，這與國(guó)內(nèi)近年來(lái)豬群流行的變異株的特征一致。
　　以10467、10567、10667和10767 TCID50/mL的HB1株分別接種BALB/c小鼠，小鼠可表現(xiàn)瘙癢和呼吸困難等典型臨床癥狀和腦多量少突膠質(zhì)細(xì)胞增生和肺泡壁增厚等病理變化。10767TCID50/mL感