梨資源ISSR分析與花芽休眠解除研究.pdf

1、梨屬薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科(Maloideae)梨屬（Pyrus L）落葉樹種，我國已有三千多年栽培歷史。梨花作為我國的傳統(tǒng)名花，不僅形態(tài)美麗，香味淡雅而且也具有深厚的文化積淀，具有極高的觀賞價(jià)值。然而梨花花芽萌動(dòng)之前需要經(jīng)過一定時(shí)間的低溫休眠，休眠解除后花芽方可萌動(dòng)。南方低需冷量早熟砂梨具有開花早，成熟早的特點(diǎn)，可以占領(lǐng)北方市場(chǎng)的空檔，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益。因此，進(jìn)行梨花資源分析和梨花芽休眠解除的研究就顯得尤為重要。

2、　　本研究從兩個(gè)方面進(jìn)行展開，一方面建立了適合南亞熱帶地區(qū)梨種質(zhì)資源的ISSR-PCR反應(yīng)體系，得出38份梨品種遺傳聚類與低溫需冷量之間的關(guān)系；另一方面以福建主栽的中需冷量品種黃花梨（Pyrus pyrifolia var. huanghua）休眠解除不同時(shí)期的花芽為材料，通過石蠟切片進(jìn)行鏡鑒，確定取材的準(zhǔn)確性和代表性。完成梨花芽休眠解除相關(guān)基因的差減文庫構(gòu)建。通過測(cè)序得出相關(guān)差異基因，并通過NCBI-BLAST對(duì)EST數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性分

3、析，運(yùn)用Blast2 go，WEGO等在線軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行GO注釋和歸類分析。找出了相關(guān)可能參與調(diào)節(jié)花芽休眠解除的基因，為梨花芽休眠解除奠定一定理論基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下：
　　1.針對(duì)梨葉片多糖多酚，單寧類物質(zhì)較多的特點(diǎn)，優(yōu)化了梨葉片基因組DNA的提取方法。建立了適合南亞熱帶地區(qū)梨品種的ISSR-PCR反應(yīng)體系，即20μL反應(yīng)體系為體系中10×PCR buffer（不含Mg2+）2μL，模板DNA濃度60 ng, TaqDNA

4、聚合酶0.75 U，引物濃度1μmol/L，dNTP濃度90μmol/L，Mg2+濃度為2.25 mmol/L。對(duì)38份梨品種的遺傳關(guān)系進(jìn)行聚類分析，以得出這38份梨品種的聚類結(jié)果與低溫需冷量之間的相互關(guān)系。實(shí)驗(yàn)從96條ISSR引物中篩選出19條特異性較好的引物，共擴(kuò)增出111條帶，其中特異性條帶86條，占77.5%。遺傳相似性系數(shù)在0.69~0.97之間，將供試品種分為西洋梨和東方梨兩個(gè)大品系。東方梨又分為豆梨，砂梨和以棕包梨為首的三

5、個(gè)聚類，在大部分砂梨的聚類分析中，其多樣性與低溫需冷量基本相關(guān)，從而為南亞熱帶地區(qū)梨品種花芽休眠解除所需的低溫需冷量研究提供一定參考依據(jù)。
　　2.對(duì)黃花梨花芽休眠解除不同時(shí)期進(jìn)行采樣，運(yùn)用石蠟切片技術(shù)對(duì)其進(jìn)行形態(tài)解剖觀察，以確定所采集樣品為處于休眠期間和休眠解除后的對(duì)應(yīng)時(shí)期。實(shí)驗(yàn)以休眠解除后的花芽為檢測(cè)子“Tester”，處于休眠期間的花芽為驅(qū)動(dòng)子“Driver”，構(gòu)建梨花芽休眠解除相關(guān)基因的正向差減文庫(PZ)；以處于休眠期間

6、的花芽為檢測(cè)子“Tester”，休眠解除后的花芽為驅(qū)動(dòng)子“Driver”，構(gòu)建梨花芽休眠解除相關(guān)基因的反向差減文庫(PF)。在1500μL的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中，取10μL菌液涂板，正向文庫共長(zhǎng)出378個(gè)菌落，其中藍(lán)斑41個(gè)，重組率為89%，可得出28350個(gè)菌落/μL連接產(chǎn)物；反向文庫共長(zhǎng)出326個(gè)菌落，其中藍(lán)斑31個(gè)，重組率為90%，24450個(gè)菌落/μL連接產(chǎn)物。菌落PCR驗(yàn)證顯示正、反向差減文庫（PZ,PF）插入片段大小均集中分布在500

7、 bp-2000 bp之間，平均插入片段大小約為750 bp。隨機(jī)挑選正、反向差減文庫（PZ,PF）各150個(gè)單克隆，正向文庫成功測(cè)序123個(gè)，占82%；反向文庫成功測(cè)序127個(gè)，占84.6%。通過NCBI-BLAST的同源性比對(duì)，得出可能與花芽休眠相關(guān) IAA、MYB1、BZIP、WRKY轉(zhuǎn)錄因子，脫水素，蛋白激酶，結(jié)構(gòu)蛋白，AP2域類轉(zhuǎn)錄因子，NADH脫氫酶，鈣結(jié)合蛋白，其中大部分為全長(zhǎng)序列。將正、反向差減文庫（PZ,PF）的測(cè)序結(jié)