茭白黑粉菌cAMP及MAPK途徑關(guān)鍵基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、茭白是我國(guó)第二大水生蔬菜,廣泛栽培于長(zhǎng)江流域及以南地區(qū),具有重要的經(jīng)濟(jì)效益。茭白的孕茭與其內(nèi)生真菌茭白黑粉菌的侵染互作關(guān)系密切,茭白黑粉菌的菌絲形態(tài)是決定茭白商品性和食用價(jià)值的關(guān)鍵因素。厚垣孢子充滿莖部的灰茭嚴(yán)重影響茭白的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蛋白質(zhì)組學(xué)和表達(dá)譜分析表明 PKA和MAPK關(guān)鍵酶在酵母型和菌絲型茭白黑粉菌中差異表達(dá)PKA,它們積極參與了菌絲形成及玉米黑粉菌等真菌從酵母型向菌絲型轉(zhuǎn)變的過(guò)程。
　　本研究以分離自“龍茭2號(hào)”正常茭和

2、灰茭的茭白黑粉菌為研究材料,利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等研究了茭白黑粉菌cAMP途徑關(guān)鍵基因(UePka)及MAPK途徑關(guān)鍵基因(UeErk、UeMkk、UeSsk)的基因結(jié)構(gòu)、不同碳源下的表達(dá)差異及基因之間的互作。結(jié)果如下:
　　一、茭白黑粉菌UePka、UeErk、UeMkk、UeSsk基因的克隆及序列分析
　　根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)了茭白黑粉菌UePka、UeErk、UeMkk、UeSsk基因的引物,反轉(zhuǎn)錄PCR獲得各

3、基因的cDNA部分序列,RACE技術(shù)獲得cDNA全長(zhǎng)序列。序列同源性分析表明,UePka與玉米黑粉菌的同源性達(dá)到93.63％, UeErk與玉米絲黑穗病菌的同源性達(dá)到82.21%,UeMkk與大麥堅(jiān)黑穗病菌的同源性達(dá)到83.53%,UeSsk與大麥堅(jiān)黑穗病菌的同源性達(dá)到78.36%。
　　UePka cDNA全長(zhǎng)為1949 bp,含有一個(gè)1230 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼410個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)的分子量約為45.78 kDa,理論等電點(diǎn)

4、為8.29,包含555 bp的5‘UTR和161 bp的3‘UTR。UeErk cDNA全長(zhǎng)為1828 bp,含有一個(gè)1659 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼553個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)的分子量約為62.05 kDa,理論等電點(diǎn)為6.60,包含7 bp的5‘UTR和10 bp的3‘UTR。UeMkk cDNA全長(zhǎng)為2204 bp,含有一個(gè)2040 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼680個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)的分子量約為72.68 kDa,理論等電點(diǎn)為8.09,包含54

5、bp的5‘UTR和107bp的3‘UTR。UeSsk cDNA全長(zhǎng)為7625 bp,含有一個(gè)5871 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼1957個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)的分子量約為214.54 kDa,理論等電點(diǎn)為5.19,包含1669 bp的5‘非編碼區(qū)(5‘UTR)和82 bp的3‘UTR。各基因3‘UTR均有典型的poly(A)尾巴。各基因的開(kāi)放閱讀框都具有絲/蘇氨酸雙特異性蛋白激酶催化域、蛋白激酶ATP結(jié)合位點(diǎn)、絲/蘇氨酸蛋白激酶活化位點(diǎn)這三個(gè)特征序

6、列。此外,UePka還具有 AGC激酶 C端特征序列,UeErk還具有MAPK保守位點(diǎn)特征序列。
　　根據(jù)四個(gè)基因的 cDNA全長(zhǎng)序列,分別設(shè)計(jì)了引物進(jìn)行茭白黑粉菌基因組序列擴(kuò)增,獲得了四個(gè)基因的基因組序列。通過(guò)與cDNA序列的比較發(fā)現(xiàn),除UePka含有一個(gè)113 bp的內(nèi)含子外,UeErk、UeMkk和UeSsk都不具有內(nèi)含子。
　　二、UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk不同碳源下的差異表達(dá)分析
　　采用

7、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了四個(gè)基因在不同碳源下的差異表達(dá)。結(jié)果表明在相對(duì)于麥芽糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天,在蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第4天時(shí),UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk的表達(dá)量上調(diào)顯著,分別為13.3、31.3、183.8、28.6倍;但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),四個(gè)基因在兩種碳源培養(yǎng)基中的表達(dá)量間沒(méi)有顯著差異。顯微觀察表明,在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第4天時(shí),酵母型黑粉菌由原來(lái)的短桿菌開(kāi)始出現(xiàn)分支并且菌體變長(zhǎng)

8、,逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫z形態(tài)。說(shuō)明不同碳源條件可以誘導(dǎo)茭白黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)變,四種基因表達(dá)量都有明顯上調(diào)表明四種基因在不同程度上都與茭白黑粉菌二型態(tài)的轉(zhuǎn)變相關(guān)。
　　三、UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk原核表達(dá)
　　分別構(gòu)建了茭白黑粉菌UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pPorf-pET-28a、pEorf-pET-28a、pMorf-pET-28a和pSorf-pET-28a并實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo)表

9、達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)條件為:37℃,180 rpm搖床培養(yǎng)1.5~2 h;OD600為0.4~0.6時(shí)加IPTG終濃度至0.2 mM,繼續(xù)培養(yǎng)5~7 h。對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了SDS-PAGE電泳分析,特異性條帶與預(yù)測(cè)的大小相符。
　　四、UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk的互作分析
　　采用Ni-NTA親和樹(shù)脂來(lái)純化目的蛋白。SDS-PAGE電泳分析表明,UePka、UeErk、UeMkk、UeSsk都純化得到了較為單一