海蜇Wnt信號(hào)途徑關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因的克隆與表達(dá).pdf

1、本文采用轉(zhuǎn)錄組454 GS FLX測(cè)序和RACE技術(shù),篩選和克隆海蜇(Rhopilema esculentum)Wnt信號(hào)途徑關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因的cDNA和基因組,利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和整體原位雜交技術(shù)分析這些基因在海蜇?zé)o性繁殖階段的表達(dá)和分布規(guī)律,探討它們?cè)诤ｒ責(zé)o性繁殖過(guò)程中的調(diào)控作用。
　　1.首次解析了海蜇Wnt4基因的cDNA和基因組結(jié)構(gòu):Re-Wnt4基因的cDNA全長(zhǎng)1212 bp,其中編碼區(qū)長(zhǎng)1032 bp,編碼了343

2、個(gè)氨基酸的多肽。SMART分析表明,Re-Wnt4具有Wnt家族共同的結(jié)構(gòu)特征,包括一個(gè)由28個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽和一個(gè)由24半胱氨酸殘基組成的Wnt4結(jié)構(gòu)域。Blast分析表明,Re-Wnt4基因與海膽、囊舌蟲(chóng)和人的Wnt4具有高度相似性?；卩徑臃?gòu)建Wnt4的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)揭示,在由人、斑馬魚(yú)Wnt家族所有成員構(gòu)建的12 Wnt亞家族系統(tǒng)樹(shù)中,Re-Wnt4基因與人和斑馬魚(yú)的Wnt4聚類成一支。Re-Wnt4基因組含有3個(gè)外顯子和2個(gè)

3、內(nèi)含子,與已獲得的其它動(dòng)物的Wnt4基因組相比較發(fā)現(xiàn),Re-Wnt4的基因組最小,結(jié)構(gòu)差異明顯。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示,Re-Wnt4基因在海蜇的螅狀體、橫裂體、碟狀體和稚水母四個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá),但存在著明顯的發(fā)育表達(dá)差異,其中橫裂體階段的表達(dá)量最高,分別是螅狀體、碟狀體和稚水母表達(dá)量的5.75、3.06和2.76倍。
　　2.首次解析了海蜇 Wnt5基因的cDNA和基因組結(jié)構(gòu):Re-Wnt5基因的cDNA全長(zhǎng)1647 bp,其

4、中編碼區(qū)長(zhǎng)1059 bp,編碼了353個(gè)氨基酸的多肽。SMART分析表明,Re-Wnt5具有Wnt家族共同的結(jié)構(gòu)特征,包括一個(gè)由20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽,2個(gè) N-糖基化位點(diǎn)和24個(gè)保守的參與二硫鍵形成的半胱氨酸。Blast分析表明,Re-Wnt5基因與來(lái)自刺胞動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物和脊索動(dòng)物的Wnt5、脊椎動(dòng)物的Wnt5a和Wnt5b具有高度相似性?；卩徑臃?gòu)建Wnt5的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)揭示,來(lái)自刺胞動(dòng)物門不同物種的Wnt5首先聚類為一支,在脊

5、索動(dòng)物文昌魚(yú)Wnt5之后,Wnt5a和Wnt5b產(chǎn)生分歧,形成了兩個(gè)進(jìn)化分支。Wnt5基因的起源可能是伴隨多細(xì)胞動(dòng)物祖先形成過(guò)程產(chǎn)生的, Wnt5a和Wnt5b兩個(gè)進(jìn)化分支發(fā)生在脊索動(dòng)物文昌魚(yú)之后。Re-Wnt5基因組含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,結(jié)構(gòu)與刺胞動(dòng)物的Wnt5、脊椎動(dòng)物 Wnt5a和 Wnt5b的基因組相似;但總長(zhǎng)度僅類似于刺胞動(dòng)物的Wnt5,明顯小于脊椎動(dòng)物Wnt5a和Wnt5b。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示, Re-Wnt5基因

6、在海蜇的螅狀體、橫裂體、碟狀體和稚水母四個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá),但存在著明顯的發(fā)育表達(dá)差異,其中橫裂體階段的表達(dá)量最高,分別是螅狀體、碟狀體和稚水母表達(dá)量的12.38、9.99和13.01倍,而表達(dá)量最低的發(fā)育階段是碟狀體階段。
　　3.首次解析了海蜇Frizzled1基因的cDNA和基因組結(jié)構(gòu):ReFzd-1基因的全長(zhǎng)cDNA為2387 bp,其中編碼區(qū)為1761bp,編碼586個(gè)氨基酸的多肽。SMART分析表明,ReFzd-1基因

7、具備Frizzled家族共同的結(jié)構(gòu)特征,包括:一個(gè)由23個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽,一個(gè)含有10個(gè)保守的半胱氨酸殘基的半胱氨酸富集域(CRD)以及由七個(gè)跨膜蛋白組成的跨膜區(qū)。Blast分析表明,ReFzd-1基因與來(lái)自刺胞動(dòng)物的貝螅H. echinata、水螅H. vulgaris、半球美螅水母C. hemisphaerica和?？鸑. vectensis具有高度相似性,與人H. sapiens,鼠M. musculus,爪蟾X. laevi

8、s和斑馬魚(yú) D. rerio的Frizzled1、Frizzled2和Frizzled7具有較高的同源性。利用N-J法將人、鼠爪蟾、斑馬魚(yú)和果蠅所有Frizzled家族基因構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)顯示,所有Frizzled家族成員聚類成11個(gè)亞家族,進(jìn)一步可劃分成4個(gè)類群,海蜇ReFzd-1基因與刺胞動(dòng)物門的Frizzled聚類在一起,然后與Frizzled1、Frizzled2和Frizzled7三個(gè)亞家族聚成一個(gè)類群。采用熒光定量RT-PCR結(jié)果

9、顯示,ReFzd-1基因在海蜇?zé)o性繁殖的四個(gè)發(fā)育階段螅狀體、橫裂體、碟狀體和稚水母均有表達(dá),其中橫裂體階段表達(dá)量最高,水母體階段表達(dá)量最低。ReFzd-1基因在海蜇內(nèi)胚層的表達(dá)高于其在外胚層的表達(dá)量,前者是后者的5倍。整體原位雜交結(jié)果顯示,在海蜇橫裂體階段,ReFzd-1主要表達(dá)在橫裂體的基盤(pán)和觸手,發(fā)生橫裂的部位也高度表達(dá)。
　　上述研究結(jié)果表明,海蜇Wnt信號(hào)調(diào)控途徑的三個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因Wnt4、Wnt5和Frizzled1參與