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文檔簡介
1、海蜇(Rhopilema esculentum)隸屬于刺胞動物門、缽水母綱、根口水母目、海蜇屬,作為一種大型的可食用經(jīng)濟水母,在我國海洋漁業(yè)中占有重要地位。其基礎(chǔ)生物學(xué)研究深入,人工繁育、增養(yǎng)殖技術(shù)成熟,是研究水母發(fā)育過程基因表達調(diào)控及水母毒素組成、結(jié)構(gòu)和功能的理想模式生物。
本研究在454轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上,通過EST序列分析、cDNA末端快速擴增(RAC E)技術(shù)從刺胞動物門的海蜇中克隆獲得兩個磷脂酶 A2基因cDNA全長
2、序列(命名為RePLA2-1、RePLA2-2)、兩個穿孔蛋白基因cDNA全長序列(命名為 RePFP-1、RePFP-2),并對這些基因進行了原核表達及重組蛋白功能分析。詳細(xì)結(jié)果信息如下:
1、RePLA2-1基因cDNA全長為824bp,開放閱讀框(ORF)504bp,能夠編碼167個氨基酸。預(yù)測RePLA2-1的分子式為C833H1283N235O241S15,推測的半衰期為30h,不穩(wěn)定指數(shù)為61.93,屬于不穩(wěn)定蛋白
3、。親水性平均數(shù)(GRAVY)為-0.124,推測該蛋白為水溶性蛋白。根據(jù)氨基酸序列預(yù)測的分子量和等電點分別是18.93KDa和8.02。RePLA2-2基因cDNA序列全長840bp,預(yù)測的開放閱讀框(ORF)包含495個核苷酸,編碼165個氨基酸序列。N-端前23個核苷酸為信號肽,5’非編碼區(qū)(UTR)和3’非編碼區(qū) UTR分別包含6個核苷酸和336核苷酸。預(yù)測RePLA2-2的分子式為C844H1278N228O232S13,分子量
4、和等電點分別是18.747KDa和8.94。推測的半衰期為30 h,不穩(wěn)定指數(shù)為32.64,屬于穩(wěn)定蛋白。親水性平均數(shù)(GRAVY)為-0.276,推測該蛋白為水溶性蛋白。利用overlap PCR技術(shù),獲得了RePLA2-1、RePLA2-2基因組全長序列。RePLA2-1基因組序列全長2937bp,由4個外顯子和3個內(nèi)含子。ReP LA2-2基因組序列全長2113bp,由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成。Blast比對結(jié)果顯示,RePLA
5、2-1、RePLA2-2屬于Phospholip_A2_3家族。系統(tǒng)進化分析表明,RePLA2-1、RePLA2-2與僧袍芋螺、星狀???、長牡蠣毒素PLA2聚為GIX PLA2一支,與GXIII、GXII PLA2家族成員共聚為pfam-collection。熒光定量PCR顯示,蜇RePLA2-1、RePLA2-2基因在海蜇不同發(fā)育階段均有表達。其中,RePLA2-1在海蜇水螅體發(fā)育階段及橫裂體發(fā)育階段具有較高表達量。在橫裂體發(fā)育階段R
6、ePLA2-1 mRNA達到四個發(fā)育階段的最高值,為碟狀體階段的12.2倍;其次為水螅體體階段,為水碟狀體階段的7.6倍;水母體階段也達到了碟狀體階段的5.5倍。RePLA2-2在海蜇水母體、碟狀體發(fā)育階段具有較高表達,分別為橫裂體階段的10.8倍和4.4倍。在水螅體階段表達量為橫裂體階段表達量的1.3倍,無明顯差異。以海蜇cDNA為模板,設(shè)計特異性引物擴增RePLA2成熟肽部分,進行原核表達。重組蛋白以包涵體的形式表達,經(jīng)純化、透析復(fù)
7、性后獲得的重組蛋白能夠水解大豆卵磷脂。
2、獲得的海蜇RePFP-1 cDNA全長2303bp,包含1883bp的開放閱讀框,能夠編碼610個氨基酸,3’UTR包括一個多腺苷酸Poly(A)尾和一個多腺苷酸化加尾信號AATAAA。RePFP-1基因組全長5786bp,由7個外顯子6個內(nèi)含子組成,所有內(nèi)含子外顯子的剪切位點均符合 GT-AG剪切規(guī)則。RePFP-2 cDNA全長2212bp,包含1842bp的開放閱讀框,編碼61
8、3個氨基酸,3’UTR包括一個多腺苷酸Poly(A)尾和一個多腺苷酸化加尾信號AATAAA。RePFP-2基因組全長8609 bp,由8個外顯子7個內(nèi)含子組成,所有內(nèi)含子外顯子的剪切位點均符合 GT-AG剪切規(guī)則。RePFP-1和RePFP-2之間氨基酸序列相似率為65%,都含有N端MACPF結(jié)構(gòu)域,與其他穿孔蛋白不同的是RePFP-1和RePFP-2蛋白C端均含有一個卵黃膜外層蛋白I結(jié)構(gòu)域(VMO I)。將RePFP-1和RePFP-
9、2與穿孔素、補體等含MACPF結(jié)構(gòu)域穿孔蛋白家族成員氨基酸序列進行進化分析,結(jié)果表明RePFP-1和RePFP-2氨基酸序列與原生生物聚為一簇。利用實時熒光定量PCR技術(shù),我們對RePFP-1和RePFP-2 mRN A在海蜇水螅體、橫裂體、碟狀體和幼水母體四個典型發(fā)育階段進行了相對表達量檢測,結(jié)果表明,盡管RePFP-1和RePFP-2在海蜇四個發(fā)育階段都具有表達,但在早期發(fā)育水螅體階段有明顯的表達上調(diào),而在幼水母體階段表達量較低。因
10、此,結(jié)合 VMOI在其他生物卵子發(fā)生過程中的作用我們推測RePFP-1和RePFP-2蛋白可能并不僅是作為毒素起作用,還可能參與海蜇早期發(fā)育的調(diào)控。在RePFP-1和RePFP-2 MACPF結(jié)構(gòu)域兩端分別設(shè)計引物,以海蜇cDNA為模板擴增海蜇 PFP蛋白 MACPF結(jié)構(gòu)域部分,并構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒pet28-RePFP-1和pet28-RePFP-2,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達菌株 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,并實現(xiàn)了重組表達。但是,重
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