鲆鰈魚Nodal信號(hào)途徑相關(guān)基因的克隆與胚胎發(fā)育早期表達(dá)分析.pdf

1、Nodal是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)超級(jí)家族中的一個(gè)成員，Nodal及其下游基因組成的通路在脊椎動(dòng)物側(cè)板中胚層、內(nèi)胚層的誘導(dǎo)和胚胎發(fā)育期左右模式的構(gòu)建中發(fā)揮了重要的作用。在斑馬魚和小鼠中的研究表明 Nodal信號(hào)途徑對(duì)胚胎發(fā)育過程中器官左右不對(duì)稱的發(fā)生起關(guān)鍵作用，此發(fā)現(xiàn)對(duì)解釋鲆鰈魚變態(tài)期間特殊的左右不對(duì)稱體制構(gòu)建提供了一條可能的研究途徑。其中，lefty作為 Nodal信號(hào)通路的下游基因，可以通過與Nodal受體的競爭結(jié)合，對(duì)其實(shí)現(xiàn)反

2、饋調(diào)節(jié)；而pitx2作為另一個(gè)下游基因，受到其激活后出現(xiàn)左右不對(duì)稱的表達(dá)，對(duì)心臟、腸道以及身體的正向旋轉(zhuǎn)都有調(diào)節(jié)作用。另外根據(jù)報(bào)道，在小鼠中，纖毛驅(qū)動(dòng)的node胞液流動(dòng)對(duì)器官正確位置的建立起著關(guān)鍵作用。纖毛軸絲動(dòng)力蛋白的重鏈，有一個(gè)環(huán)狀馬達(dá)結(jié)構(gòu)域，水解 ATP后，會(huì)經(jīng)歷一個(gè)構(gòu)像變化，從而帶動(dòng)動(dòng)力蛋白以“桿”作為支點(diǎn)運(yùn)動(dòng)。其中，dnah9基因編碼其中的一條重鏈。在小鼠模型中，DnaH家族基因編碼的軸絲動(dòng)力蛋白出現(xiàn)在原結(jié)纖毛中，顯示了其與早

3、期基因的表達(dá)和后期器官偏轉(zhuǎn)的關(guān)聯(lián)。本研究通過同源克隆和RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技術(shù)獲得了舌鰨lefty和pitx2，以及牙鲆dnah9的全長cDNA，利用生物軟件對(duì)基因進(jìn)行了生物信息學(xué)的預(yù)測分析，并借助于實(shí)時(shí)熒光定量、原位雜交等技術(shù)對(duì)3種基因不同發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行了研究。同時(shí)，本文還研究了半滑舌鰨胚胎發(fā)育過程中、各組織以及化學(xué)處理前后的內(nèi)參基因的表達(dá)變化，篩選出了適合該物種基因表達(dá)

4、研究的內(nèi)參體系。具體結(jié)果總結(jié)如下：
　　1.半滑舌鰨內(nèi)參基因的篩選
　　不同發(fā)育時(shí)期，geNorm運(yùn)算得到GAPDH和B2M最為適用，而BestKeeper得到GAPDH和18S最為適用。對(duì)于不同的組織類型，兩軟件結(jié)果相同得出相同的內(nèi)參基因，最適內(nèi)參基因?yàn)?8S和RPL17。對(duì)于化學(xué)處理，geNorm運(yùn)算結(jié)果為B2M/TUBA，而Bestkeeper結(jié)果為UBCE/TUBA。
　　2.半滑舌鰨lefty和pitx2基因

5、克隆及表達(dá)
　　本文使用同源克隆的方法分別獲得了半滑舌鰨lefty和pitx2基因的開放閱讀框，其中l(wèi)efty總長972 bp，推測編碼324個(gè)氨基酸；pitx2總長939 bp，推測編碼313個(gè)氨基酸。pitx2編碼的蛋白質(zhì)在Homeobox和OAR兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的區(qū)域表現(xiàn)了極強(qiáng)的保守性。lefty與pitx2都存在母源性表達(dá)的現(xiàn)象，但是lefty體現(xiàn)為瞬時(shí)表達(dá)，主要集中在胚胎發(fā)育階段；pitx2除了在胚胎發(fā)育階段表達(dá)之外，在成體中

6、也表達(dá)，但表達(dá)量略有下降。其表達(dá)方式與其自身的作用相一致。
　　3.牙鲆dnah9的cDNA全長的克隆及表達(dá)
　　采用同源克隆與基因組文庫相結(jié)合的方法，從褐牙鲆中克隆獲得了dnah9的cDNA全長序列。cDNA的開放閱讀框全長13,611 bp，3'UTR長384 bp，推測編碼4573個(gè)氨基酸。該基因在基因組 DNA上有兩個(gè)拷貝，以串聯(lián)的形式排列。第一個(gè)拷貝，總長62,632 bp，共有100個(gè)外顯子；第二個(gè)拷貝總長128