棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生形態(tài)、遺傳分析及初始脫分化相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、棉花不僅是主要的纖維作物，還是重要的油料和蛋白質(zhì)資源，是世界上主要的經(jīng)濟(jì)作物之一。棉花生產(chǎn)穩(wěn)定與否，直接關(guān)系到整個(gè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)民收入和紡織工業(yè)的發(fā)展。因此，對(duì)棉花品種進(jìn)行不斷的改良和創(chuàng)新，培育出更多高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆的新品種，成為棉花育種家們不斷追求的目標(biāo)。棉花組織培養(yǎng)是育種研究中的有效手段，可以通過(guò)各種生物技術(shù)手段加速育種進(jìn)程，提高育種效率，創(chuàng)造新的育種材料，并可為現(xiàn)代分子育種和基因工程研究提供有效的實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段。棉花組織培養(yǎng)工作起步較

2、晚，而且棉花是被公認(rèn)的體細(xì)胞胚胎發(fā)生困難和難于體外遺傳操作的作物之一。因此，研究亞洲棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生、棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的起源以及遺傳規(guī)律，以及從分子水平揭示棉花細(xì)胞脫分化現(xiàn)象等方面的工作，是進(jìn)一步完善棉花轉(zhuǎn)基因體系的重要途徑。本研究的主要結(jié)果如下：
　　 1、對(duì)四十個(gè)亞洲棉品種進(jìn)行了愈傷誘導(dǎo)，以及后期的分化調(diào)控處理，為建立亞洲棉再生體系積累了資料。所有的亞洲棉品種在2,4-D+KT，NAA+KT，IBA+KT三種常用植物激素組

3、合條件下都容易誘導(dǎo)出愈傷，出愈率均為100％。但在不同激素組合上的愈傷狀態(tài)顯著不同，繼代處理表明NK處理更適合于后期的分化調(diào)控處理，能夠獲得狀態(tài)較好的愈傷。此后，通過(guò)改變培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基組分，以及其他處理等方式或組合上述處理等方式進(jìn)行分化調(diào)控，使用了近300種培養(yǎng)基，僅在卡寶品紅染色時(shí)發(fā)現(xiàn)了部分類(lèi)似于胚性愈傷的細(xì)胞，但未獲得體細(xì)胞胚。
　　 2、對(duì)YZ1進(jìn)行了不同激素組合條件下的體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究，建立了高效快速的再生體系；并利

4、用組織切片的方法觀(guān)察了體細(xì)胞胚胎發(fā)生的過(guò)程，表明不同植物激素處理?xiàng)l件下的體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式是不同的。YZ1在8種植物激素（包括不含植物激素）處理上均能通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式獲得再生植株。但不同處理間的體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力存在顯著差異，IBA+KT處理表現(xiàn)出最高的分化率，可以達(dá)到97.6％，是常用植物激素組合2,4-D+KT處理中分化率28.6％的3倍。同時(shí)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，整個(gè)體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程（從外植體接種到體細(xì)胞胚的出現(xiàn)）僅為33天，是目前棉

5、花體細(xì)胞胚胎發(fā)生耗時(shí)最短的報(bào)道。YZ1也能夠在不含植物激素的MSB培養(yǎng)基上也能夠獲得分化。此外，組織學(xué)觀(guān)察表明，2,4-D+KT和IBA+KT處理中的體細(xì)胞胚胎發(fā)生模式不同，胚性細(xì)胞團(tuán)分別起源于初生形成層和皮層細(xì)胞，從一定程度上解釋了IBA+KT處理能夠快速促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的原因。
　　 3、通過(guò)構(gòu)建陸海雜種F1及F2群體，以及8個(gè)不同再生能力品種的完全雙列雜交，研究棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生遺傳規(guī)律。選擇容易再生的陸地棉品種Coke

6、r201與再生困難的海島棉品種Pima90雜交獲得F1,利用不同植物激素組合誘導(dǎo)兩個(gè)親本和F1進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生，Pima90和F1均不能體細(xì)胞胚胎發(fā)生；次年自交獲得F2種子，F(xiàn)2個(gè)體經(jīng)過(guò)半年多的誘導(dǎo)調(diào)控處理未見(jiàn)一個(gè)個(gè)體分化。隨后，對(duì)容易再生的陸地棉品種Coker201,Coker312,Y668，YZ1,再生困難的陸地棉品種TM-1,EK4及海島棉品種Pima90和Pima3-79，進(jìn)行完全雙列雜交，獲得了47個(gè)雜種F1代種子，同樣進(jìn)

7、行愈傷誘導(dǎo)和分化調(diào)控處理，僅有陸地棉之間的兩個(gè)雜種獲得了再生，且其對(duì)應(yīng)的反交沒(méi)有獲得再生。隨后，選擇正反交均不能分化的F1（YZ1和EK4雜交獲得）進(jìn)行自交，獲得的F2群體進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生遺傳規(guī)律分析；僅有YZ1作父本的F2群體中有14個(gè)個(gè)體獲得了胚性愈傷，且胚性愈傷狀態(tài)各異，胚胎發(fā)生能力間也存在顯著差異。表明體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力是一種復(fù)雜的遺傳性狀，可能同時(shí)受細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)多個(gè)基因的互作控制。
　　 4、構(gòu)建細(xì)胞脫分化相關(guān)基

8、因的SSH文庫(kù)，對(duì)部分相關(guān)基因進(jìn)行了表達(dá)分析，并提出了可能的SAM-dependent轉(zhuǎn)甲基調(diào)控細(xì)胞脫分化的分子機(jī)制，部分相關(guān)基因進(jìn)行了初步的功能驗(yàn)證。利用來(lái)自三種不同激素處理誘導(dǎo)6，12,24，72,168小時(shí)的下胚軸的cDNA作為tester，以下胚軸的切段作為driver，進(jìn)行差異表達(dá)基因的差減和兩輪PCR擴(kuò)增后，獲得棉花細(xì)胞脫分化相關(guān)基因的SSH差減文庫(kù)。對(duì)反向Northern雜交中的差異表達(dá)明顯的克隆進(jìn)行測(cè)序，共有286個(gè)差異

9、表達(dá)的cDNA克隆被測(cè)序，112個(gè)獨(dú)立的EST被分離鑒定，且其中有40.2％的EST是第一次被分離鑒定，可能為新發(fā)現(xiàn)的棉花細(xì)胞初始脫分化相關(guān)基因。對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)分析表明，GST在植物激素誘導(dǎo)初期的6-24小時(shí)內(nèi)高度表達(dá)，PRPs在不同處理中優(yōu)勢(shì)表達(dá)并表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，表明它們可能與棉花細(xì)胞脫分化關(guān)系密切。此外，棉花SAM代謝途徑中假定的GhSAMS，GhSAMDC，GhSAHH和GhACO3被鑒定，realtime-PCR分析表明

10、，它們的表達(dá)水平在激素誘導(dǎo)初期出現(xiàn)兩次明顯的上升/下降過(guò)程，且GhSAMS和GhSAHH的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平表現(xiàn)出高度正相關(guān)，進(jìn)一步推測(cè)高表達(dá)水平的GhSAMS可能與脫分化細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期密切相關(guān)。組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察進(jìn)一步表明，2,4-D處理?xiàng)l件下的部分細(xì)胞在72小時(shí)內(nèi)完成脫分化和分裂過(guò)程，SAM-dependent轉(zhuǎn)甲基途徑可能通過(guò)兩次轉(zhuǎn)甲基活性的改變調(diào)控棉花細(xì)胞脫分化過(guò)程。此外，差異表達(dá)基因在不同處理中的表達(dá)模式表明了2,4-D和激動(dòng)素之

11、間存在著復(fù)雜的互作關(guān)系。
　　 此外，我們借助Gateway技術(shù)構(gòu)建了Extensin和PRPL的RNAi干涉表達(dá)載體以及SAMS、EF1A4、PRPL的超表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化YZ1下胚軸。其中PRPL的RNAi轉(zhuǎn)化的下胚軸分化率較對(duì)照明顯降低，初步推測(cè)可能是PRPL的干涉影響正常的細(xì)胞脫分化進(jìn)程，進(jìn)而導(dǎo)致正常的體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)程受限。此外，三個(gè)超表達(dá)基因都已經(jīng)獲得了胚性愈傷和再生植株，PCR檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為72.