棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)基因GhHmgB3的克隆及功能分析.pdf

1、棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,對(duì)其體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程的研究是現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用于遺傳育種的基礎(chǔ)。同時(shí),作為細(xì)胞全能性的經(jīng)典例證,植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生又是生命研究的一個(gè)重要模型。深入了解該過程的發(fā)生機(jī)制、優(yōu)化棉花的再生體系具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。
　　 本研究以發(fā)掘控制體細(xì)胞胚胎發(fā)生調(diào)控的關(guān)鍵基因?yàn)槟康?克隆了HmgB家族的四個(gè)成員,通過對(duì)該家族的胚性組織特異表達(dá)成員GhHmgB3功能的深入研究,以及相關(guān)基因的表達(dá)模式的系統(tǒng)分析,對(duì)體細(xì)

2、胞胚胎發(fā)生這一獨(dú)特的生命過程的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探討。研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.用BD SMART RACE技術(shù)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RACE擴(kuò)增,克隆了HmgB家族的4個(gè)成員。通過Real-time PCR分析各個(gè)家族成員在根、莖、葉、合子胚、體細(xì)胞胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期的表達(dá)模式。參考小鼠HmgB基因的命名方式,把兩個(gè)組成型表達(dá)的基因命名為GhHmgB1(HM449081)和GhHmgB2(HM449078)；在胚性組織特異表達(dá)的基因命

3、名為GhHmgB3(HM449079)；在非胚性組織表達(dá)的基因命名為GhHmgB4(HM449080)。并選定GhHmgB3做下游的功能分析。
　　 2.用生物信息學(xué)工具Blast分析GhHmgB3的結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)該基因包含一個(gè)Hmg box結(jié)構(gòu)域,與擬南芥HmgB3的同源度最高。結(jié)合Real-time PCR、Northernblotting對(duì)該基因在根、莖、葉、合子胚發(fā)育以及體細(xì)胞胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該基

4、因在合子胚的子葉胚時(shí)期、體細(xì)胞胚胎發(fā)育的整個(gè)階段優(yōu)勢表達(dá)。
　　 3.選取一段包含GhHmgB3保守結(jié)構(gòu)域和3’特異區(qū)(207—391)的序列,用Clontech的Gateway技術(shù)構(gòu)建RNAi載體。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化陸地棉Coker201的下胚軸和胚性愈傷,篩選并鑒定多個(gè)轉(zhuǎn)基因胚性愈傷系。
　　 4.全程觀察、記錄轉(zhuǎn)基因材料在體細(xì)胞脫分化和胚性細(xì)胞分化的各個(gè)階段的表型。以轉(zhuǎn)空載體的材料作為對(duì)照,GhHmgB3

5、抑制表達(dá)的體細(xì)胞脫分化的速度和程度都優(yōu)于對(duì)照,但是最終它們無法分化為胚性細(xì)胞。另一方面,GhHmgB3抑制表達(dá)的胚性愈傷材料的增殖和分化能力優(yōu)于對(duì)照,但是無法長成正常的植株。
　　 5.用Solexa sequencing技術(shù),發(fā)掘轉(zhuǎn)基因干涉胚性愈傷和對(duì)照之間差異表達(dá)的基因。通過對(duì)差異表達(dá)基因的gene ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes(KEGG)分析,在棉花

6、的體細(xì)胞胚胎發(fā)育過程中存在一系列β-catenin相關(guān)的途徑控制著體細(xì)胞胚的增殖、生長和分化。系統(tǒng)分析一系列相關(guān)基因的表達(dá)量變化,并結(jié)合Real-time PCR的驗(yàn)證,推斷抑制GhHmgB3激活了β—catenin的表達(dá),從而促進(jìn)了增殖。β-catenin的異常表達(dá)激活了stress induced-MAPK/p38途徑,減少β-catenin和TCF/LEF結(jié)合,導(dǎo)致核內(nèi)β-catenin/TCF途徑被抑制。因?yàn)棣?catenin/

7、TCF和β-catenin/cadherin的競爭關(guān)系,更多的β-catenin和細(xì)胞骨架結(jié)合,促進(jìn)了細(xì)胞的分化。
　　 6.用5-氟脲嘧啶處理細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞周期分析,結(jié)果顯示:GhHmgB3干涉的胚性愈傷的細(xì)胞周期進(jìn)程要短于對(duì)照。同時(shí)用MTS assay酶活檢測的方法檢測細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因材料的增殖能力要強(qiáng)于對(duì)照。
　　 7.結(jié)合β-catenin/TCF pathway下游基因以及MAPK pathway

8、代表基因在干涉材料和對(duì)照中的表達(dá)模式,取狀態(tài)均一胚性愈傷細(xì)胞進(jìn)行正常狀態(tài)下細(xì)胞周期分析,結(jié)果顯示GhHmgB3表達(dá)受到抑制的細(xì)胞更多地停留在G1期,β-catenin的核內(nèi)信號(hào)受到了抑制。
　　 8.分析β-catenin和細(xì)胞骨架相關(guān)基因的表達(dá)模式,Real-time PCR結(jié)果顯示Actin10在干涉材料中的表達(dá)量高于對(duì)照。結(jié)合體胚標(biāo)記基因SERK和Solexa結(jié)果中鈣離子相關(guān)基因(CAM和CDPK)的表達(dá)模式推斷:β-ca