小鼠精子發(fā)生相關(guān)基因的克隆及分析.pdf

1、哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞分化過(guò)程，可分為有絲分裂期、減數(shù)分裂期和精子形成期三個(gè)階段。精原細(xì)胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生初級(jí)精母細(xì)胞。初級(jí)精母細(xì)胞通過(guò)第一次減數(shù)分裂產(chǎn)生兩個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞，次級(jí)精母細(xì)胞的間期很短，不發(fā)生DNA復(fù)制就進(jìn)入第二次減數(shù)分裂，形成單倍體的圓形精子細(xì)胞。圓形精子細(xì)胞通過(guò)一系列復(fù)雜的形態(tài)變化，發(fā)育為具有頭、頸、尾結(jié)構(gòu)的精子。精子發(fā)生過(guò)程受許多特異分子及細(xì)胞間作用的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，包括染色體結(jié)構(gòu)的變化及一系列特定基因的程序性表達(dá)

2、。這些內(nèi)在基因水平的變化又受許多外部因素如激素、環(huán)境因素及旁分泌細(xì)胞因子的影響。對(duì)調(diào)節(jié)精子發(fā)生過(guò)程中一系列特殊現(xiàn)象的分子機(jī)制所知甚少，尤其缺乏對(duì)關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因的認(rèn)識(shí)。本研究試圖篩選出在精子發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用的基因或蛋白，并研究其功能，從而進(jìn)一步認(rèn)識(shí)精子發(fā)生的分子機(jī)理。論文主要包括以下主要內(nèi)容。 一．小鼠精子發(fā)生相關(guān)新基因(SRG-L)的全長(zhǎng)克隆。在前期研究小鼠不同階段生精細(xì)胞基因表達(dá)譜的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在精子發(fā)生后期高表達(dá)的新

3、基因。隨后將該基因PCR產(chǎn)物純化、克隆、測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該片段與GenBank中大鼠及猴的一個(gè)睪丸基因eDNA片段有很高的同源性，但均未見(jiàn)其相關(guān)功能的報(bào)道。根據(jù)已知的大鼠及猴的同源基因cDNA序列設(shè)計(jì)數(shù)對(duì)引物，利用重疊RT-PCR分別擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為448bp、1122 bp、280bp、523bp和561bp的5個(gè)片段，經(jīng)序列測(cè)定后進(jìn)行拼接，得到2584 bp的cDNA片段。然后利用5'和3'cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplific

4、ation of cDNAEnds，RACE)技術(shù)，獲得該基因的5'及3'末端序列，由此完成了該基因全cDNA的測(cè)定，該基因?yàn)橐恍碌男∈蠡?，命名為SRG-L(spermatogenesis related gene expressedin the late stages of spermatogenic cells)，并在GenBank中注冊(cè)(接受號(hào)為AY352586)二．SRG-L表達(dá)特征分析。RT-PCR和Northern Blo

5、tting分析表明：該基因在早期A型和B型精原細(xì)胞中不表達(dá)，從雙線期初級(jí)精母細(xì)胞階段開(kāi)始表達(dá)并逐漸上調(diào)，在粗線期初級(jí)精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞及長(zhǎng)形精子細(xì)胞中均檢測(cè)到高水平的mRNA，但在成熟精子中消失，具有明顯的階段特異性表達(dá)特征，并且組織特異性表達(dá)分析顯示該基因在睪丸組織中的呈高表達(dá)。Western Blotting和免疫組織化學(xué)染色分析進(jìn)一步證實(shí)，SRG-L基因產(chǎn)物主要存在于雙線期/粗線期精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞及長(zhǎng)形精子細(xì)胞中。因此初

6、步判斷這個(gè)基因在減數(shù)分裂早期被激活，轉(zhuǎn)錄在整個(gè)精子形成期維持較高水平的表達(dá)，有可能在精子發(fā)生后期起特殊作用，與減數(shù)分裂和精子變態(tài)成形相關(guān)。 三.SRG-L生物信息學(xué)分析。經(jīng)GenBank/Blast(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)檢索，證明這SRG-L序列為一個(gè)新的小鼠基因，全長(zhǎng)cDNA為2843bp，包括2625bp完整的開(kāi)放閱讀框架(open reading frame，ORF)，50bp-

7、2674bp為編碼區(qū)，編碼產(chǎn)生874個(gè)氨基酸的蛋白，分子量為104KD。翻譯起始密碼ATG上游-3位是A，下游+4位是G，構(gòu)成AGAATGG，屬于典型的“Kozak”序列。3′UTR 2831nt處有poly(A)尾，其上游29nt有典型的加尾信號(hào)(AATAAA)，無(wú)典型的啟動(dòng)子序列，如CCAAT box或TATA box。同源分析顯示小鼠SRG-L與GenBank中大鼠、猴、人和狗等的同源基因無(wú)論在核酸水平還是編碼蛋白水平都具有較高的

8、同源性，表明該基因在進(jìn)化上的高度保守。經(jīng)Genebank/Blast分析，SRG-L定位在小鼠第八號(hào)染色體短臂33.1位點(diǎn)，跨越基因組29Kb，由18個(gè)外顯子和17個(gè)內(nèi)含子組成，外顯子和內(nèi)含子之間符合標(biāo)準(zhǔn)的ag/gt法則。生物信息學(xué)分析顯示在其N端184-270aa可能存在一跨膜區(qū)，預(yù)測(cè)該氨基酸序列為非分泌型蛋白，并且分別在Ser、Thr及Tyr存在多個(gè)潛在的磷酸化修飾位點(diǎn)和5個(gè)潛在的甲基化修飾位點(diǎn)。SRG-L不存在N端信號(hào)肽，線粒體定

9、位序列，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜滯留信號(hào)，RNA結(jié)合序列等。GenBank/NCBI Conserved Domain Search(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)SRG-L可能存在兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，分別是N端的(178-210aa)Transglutaminase/protease-like homologues domain和C端的(723-766aa)D-serine