小鼠精子發(fā)生相關(guān)基因spata3的表達(dá)分析.pdf

1、研究目的:
　　 分析小鼠精子發(fā)生相關(guān)基因spata3 mRNA及其編碼蛋白產(chǎn)物的表達(dá)特性，揭示該基因在精子細(xì)胞變態(tài)成形過程中的作用，為深入理解男性不育癥的發(fā)病機(jī)理積累實驗室資料。
　　 研究方法:
　　 1.應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)分析spata3 mRNA的組織表達(dá)特異性;
　　 2.利用實時熒光定量PCR方法分析spata3 mRNA在不同周齡小鼠睪丸組織中的差異性表達(dá);
　　 3.通過分

2、子克隆技術(shù)構(gòu)建spata3原核表達(dá)載體，并實現(xiàn)spata3在大腸桿菌中的可溶性表達(dá);通過親和層析純化獲得GST-SPATA3融合蛋白并利用Westem blot印跡雜交加以驗證;以純化的融合蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔，制備抗SPATA3多克隆抗體，ELISA測定抗體效價，Westem blot檢測抗體特異性;
　　 4.利用免疫組織化學(xué)染色分析SPATA3蛋白在小鼠曲精小管中的細(xì)胞定位;
　　 5.利用多重間接免疫熒光技

3、術(shù)分析SPATA3蛋白在精子細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位;
　　 6.通過免疫共沉淀技術(shù)分析SPATA3蛋白與微管蛋白α-tubulin的相互作用。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.半定量RT-PCR分析表明spata3 mRNA具有顯著的睪丸組織特異性表達(dá)特征;
　　 2.實時熒光定量PCR結(jié)果顯示spata3 mRNA在5周齡及8周齡雄性小鼠睪丸組織中高表達(dá)，可能與精子發(fā)生后期密切相關(guān);
　　 3.酶切圖譜

4、分析與DNA序列測定表明spata3原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)及親和層析純化后獲得融合蛋白GST-SPATA3，Western blot印跡雜交證明純化的重組蛋白具有高度的特異性。ELISA測定顯示抗SPATA3多克隆抗體效價可達(dá)1:102,400，Westernblot顯示該抗體可與SPATA3蛋白特異結(jié)合，具有識別特異性;
　　 4.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示SPATA3蛋白在小鼠曲精小管中主要定位在圓形精子細(xì)胞和長形精

5、子細(xì)胞內(nèi);
　　 5.多重間接免疫熒光染色分析表明SPATA3蛋白與精子細(xì)胞變態(tài)成形過程出現(xiàn)的精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)共定位在圓形及長形精子細(xì)胞核表面，并伴隨精子細(xì)胞核的改變而出現(xiàn)形態(tài)及定位的動態(tài)變化;
　　 6.免疫共沉淀實驗尚未證明SPATA3與α-tubulin能夠在體外形成免疫沉淀復(fù)合物，需利用其他方法進(jìn)一步驗證。
　　 研究結(jié)論:
　　 1.spata3 mRNA在小鼠睪丸組織中高表達(dá)，具有顯著的組織表達(dá)特異

6、性。在5周齡及8周齡小鼠睪丸組織中spata3 mRNA處于高水平轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，具有顯著的階段特異性表達(dá)，提示該基因與精子發(fā)生后期過程密切相關(guān);
　　 2.SPATA3蛋白定位在圓形精子細(xì)胞和長形精子細(xì)胞核周，并且與精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)在形態(tài)改變及發(fā)育時間上具有高度的吻合性，提示該蛋白可能與精子領(lǐng)共同參與了精子細(xì)胞核的濃縮變形過程;
　　 3.SPATA3蛋白與α-tubulin能夠在體外形成免疫沉淀復(fù)合物，說明二者之間存在一定的相互