用慢病毒rna干擾系統(tǒng)研究精子發(fā)生相關基因znf230的功能

1、摘要：項目研究內容和意義簡介項目研究內容和意義簡介（限400字）：RNA干擾（RNAinterferenceRNAi）是由雙鏈RNA介導的序列特異性的mRNA降解所致的轉錄后基因沉默過程。RNAi技術可方便快捷地研究基因的功能，并用于功能基因的篩選。本課題擬采用RNAi及胚胎干細胞體外定向分化技術，將我室新克隆的精子發(fā)生相關基因znf230的siRNA通過慢病毒（Lentivirus）系統(tǒng)引入小鼠胚胎干細胞，體外模擬精子發(fā)生過程，而在細

2、胞水平上研究znf230基因表達受抑后對生精的影響，同時結合基因表達譜芯片及蛋白組二維電泳質譜技術實現基因功能性及蛋白質表達篩查，以期全面研究該基因的功能。上述技術平臺的建立將提供一個精子發(fā)生相關基因功能研究的模型，亦為RNAi技術的應用研究拓展了新的思路。這一設想尚未見文獻報道，如能證明其合理有效，將成為難于鑒定表型且異常表達的基因功能研究的通用模型，并在后續(xù)蛋白組學及基因相關藥物的研發(fā)中發(fā)揮重要作用。報告正文報告正文因此，建立高效、

3、穩(wěn)定長期表達的RNAi傳遞系統(tǒng)正是該領域目前研究的關鍵。雖然逆轉錄病毒的運用能有效地降低靶基因的表達[11]，但MMLV類病毒自身特點及對細胞類型的選擇性使其應用受到一定的限制。當前，新型第三代慢病毒(Lentivirus)系統(tǒng)正以其高效、穩(wěn)定的特性在RNAi研究中倍受關注。Lentivirus來源于HIV1病毒，其宿主細胞范圍廣泛，包括分裂細胞、非分裂細胞、原始細胞等，且轉基因在生殖系統(tǒng)中可穩(wěn)定傳遞[1213]。Pfeifer[14]

4、等的研究結果表明，Lentivirus介導的轉基因均可在鼠胚胎干細胞(EmbryonicStemES)體內、外分化過程中表達，將Lentivirus感染的ES細胞注入胚泡期或桑椹期胚胎，發(fā)育的新生鼠及其子代的多種組織中均可檢測到轉基因。Tiscnia[15]等將沉默GFP的Lentivirus感染GFP陽性轉基因鼠卵細胞，發(fā)現新生鼠體內GFP熒光蛋白的表達明顯降低。Rubison[16]等運用CD8CD25siRNA的Lentiviru

5、s載體轉染鼠ES細胞，生成了“knockdown”轉基因鼠，其效應維持長達30天之久并可傳遞下一代，充分顯示了該方法的優(yōu)越性。精子發(fā)生是一個復雜的多階段的細胞分化過程，涉及生精細胞的生長、分裂、分化和信號傳遞等，要求一系列基因表達的精確調控[1718]。這些基因的異常將導致精子發(fā)生障礙，表現為寡精癥或無精癥。近年來我室分離克隆了一系列可能與精子發(fā)生相關的基因[1922]，目前已初步闡明了這些基因的結構與表達，如ZNF230在無精癥患者睪

6、丸組織中無表達，znf230在小鼠睪丸內特異表達且可能在精細胞(spermatid)形成階段起重要作用[22]。由于生精過程極其復雜，這些基因的調控及其生物學功能尚未明了。為探索此類問題，首先需建立供研究的模型系統(tǒng)。2003年末，ToshiakiNoce研究小組[23]成功地將小鼠ES細胞在體外定向分化成精子。研究中，懸浮培養(yǎng)的ES細胞在BMP4刺激及擬胚體立體空間構型的影響下向原始生殖細胞(primdialgermcellsPGCs)

7、分化，具PGCs性質的ES細胞aggregation移植至裸鼠的睪丸囊中即可發(fā)育成成熟的精子。此外，Daley及Geijsen等研究小組[24]也報道了ES細胞體外分化成精子的新進展?；谝陨蟁NAi研究所取得的成果，結合鼠ES細胞體外定向分化新技術，我們設想如能將Lentivirus系統(tǒng)引入小鼠ES細胞使之長期穩(wěn)定表達、發(fā)揮RNAi效應，則可模擬興趣基因在特定疾病中的異常表達情況，進而確定其功能。因此，可將ES細胞在體外定向分化成精子