鐵皮石斛體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究.pdf

1、本文以鐵皮石斛原球莖為材料，在愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生、體細(xì)胞胚胎發(fā)生的形態(tài)學(xué)過程、體胚發(fā)生過程中同工酶的變化以及體胚發(fā)生過程中的基因表達(dá)四個(gè)方面進(jìn)行了研究，主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1．以已分化出兩片幼葉的原球莖為外植體，建立了通過愈傷組織的植株再生體系，探討了不同外源激素對(duì)外植體出愈及愈傷組織分化的影響。將外植體培養(yǎng)在附加2.0 mg 1<'-1> 6-BA的1/2MS培養(yǎng)基上出愈率可達(dá)82％，繼代2次后的愈傷組織在不添加外源激素的

2、1/2MS基本培養(yǎng)基上能夠很好地實(shí)現(xiàn)類原球莖再生，當(dāng)類原球莖進(jìn)一步培養(yǎng)在添加0.2 mg 1<'-1>NAA的1/2MS培養(yǎng)基上可發(fā)育形成幼苗，將再生植株煉苗后移栽到蛭石中，成活率可達(dá)95％。 2．通過石蠟切片技術(shù)，以處于不同分化階段的愈傷組織為材料，研究了體細(xì)胞胚胎發(fā)生的細(xì)胞學(xué)過程。結(jié)果表明體胚既可起源于愈傷組織的表層，又可起源于愈傷組織內(nèi)層的單個(gè)胚性細(xì)胞。內(nèi)起源體胚的早期胚胎發(fā)生過程與鐵皮石斛體內(nèi)胚胎發(fā)育過程相一致，主要經(jīng)單

3、細(xì)胞胚、二細(xì)胞胚、四細(xì)胞胚、五細(xì)胞胚以及球形胚；球形胚以后的發(fā)育過程與鐵皮石斛種子體外萌發(fā)所經(jīng)歷的過程相一致，主要經(jīng)球形胚、心形原球莖、子葉原球莖直至成苗。 3．在上述實(shí)驗(yàn)體系之上，以不同發(fā)育時(shí)期含體胚的愈傷組織為材料，進(jìn)行了過氧化物酶、過氧化氫酶、細(xì)胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶、酶酯、蘋果酸脫氫酶、淀粉酶、乙醇脫氫酶的同工酶及過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶三種抗氧化酶的活性研究，結(jié)果表明這些酶在體胚發(fā)生過程中呈現(xiàn)一定的

4、規(guī)律性變化，酯酶、細(xì)胞色素氧化酶、乙醇脫氫酶同工酶在心形原球莖期都出現(xiàn)新的特異性條帶，而蘋果酸脫氫酶同工酶中的一條酶帶在心形原球莖時(shí)期消失；三種抗氧化酶活性都在單細(xì)胞體胚發(fā)生時(shí)期達(dá)到峰值。 4．在鐵皮石斛體胚發(fā)生基礎(chǔ)之上，用RT-PCR技術(shù)在體胚發(fā)生過程中檢測(cè)到與胚胎發(fā)育相關(guān)的TIM和CUC基因，通過3’-RACE和5’-RACE獲得了TIM和CUC mRNA序列，并初步對(duì)TIM和CUC進(jìn)行了序列分析。 綜上，本實(shí)驗(yàn)建立