紅松體細胞胚胎發(fā)生及超低溫保存技術研究.pdf

1、本研究以紅松(Pinus koraiensis sieb. Et zucc.)未成熟合子胚為外植體，誘導體細胞胚胎發(fā)生，研究了紅松體細胞胚胎發(fā)生的各種影響因素、胚性愈傷組織在體細胞胚胎誘導過程中的生理生化特性以及愈傷組織的超低溫保存，具體結果如下： 1、分別于7月5日、7月15日、7月25日采收紅松未成熟合子胚，在添加2,4-D 1.0、2.0、4.0mg/L，6-BA 0.5、1.0、2.0mg/L GLH 誘導培養(yǎng)基上誘導愈

2、傷組織。結果表明：未成熟合子胚的采樣時間(發(fā)育程度)、2,4-D和6-BA的濃度極顯著影響紅松愈傷組織的誘導率。多重比較可知7月5日前后為紅松未成熟合子胚的最佳采樣時期，2,4-D 2.0mg/L＋6-BA1.0mg/L為誘導紅松愈傷組織的最佳生長調節(jié)劑濃度組合，最高誘導率達43.33％。 2、紅松胚性愈傷組織增殖階段的生長曲線基本呈“S”形，繼代20d后胚性愈傷組織增長趨于停滯。胚性愈傷組織生長率先快后慢，生長率最大值出現(xiàn)在繼

3、代后第12d 左右。研究結果表明了紅松胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)階段適宜的繼代頻率為每2-3周繼代一次。 3、分別在GLH 培養(yǎng)基上添加不同濃度的蔗糖、ABA、PEG 來誘導紅松體細胞胚，結果表明不同濃度的蔗糖、ABA 對紅松體細胞胚胎的誘導有極顯著影響，GLH＋蔗糖60g/L＋ABA 20mg/L為誘導紅松體細胞胚胎的最佳培養(yǎng)基，體細胞胚誘導數(shù)量達到47.5個/克愈傷組織，但PEG對紅松體細胞胚的誘導并沒有顯著影響。誘導所得體細胞胚

4、在萌發(fā)培養(yǎng)基(GLH＋蔗糖20g/L)上萌發(fā)率為73.3％。萌發(fā)后生成的體胚苗移栽成活率為64.3％。 4、成熟胚誘導階段紅松胚性愈傷組織內可溶性總糖與蔗糖含量變化趨勢相似，兩者都是0-5d 迅速上升，5-15d下降，15-25d再上升，之后保持平穩(wěn)。可溶性蛋白質含量在0-10d升高，10-20d降低，20d后又上升并有分子量大小約為63.2和31.7KD兩種特異蛋白出現(xiàn)，這些特異蛋白可能作為體細胞胚胎形成的調控因子或結構蛋白而

5、起作用。糖分與蛋白含量在此階段均出現(xiàn)先上升、后下降再上升的變化趨勢，這這表明此階段胚性愈傷組織內代謝旺盛，體細胞胚胎正在形成。 5、紅松愈傷組織分別預處理0、12、24、36、48h后用6種不同的冷凍保護劑進行超低溫保存，保存3d后用4種不同方法解凍，結果表明：利用0.4mol/L 山梨醇(Sorb)溶液將紅松愈傷組織預處理24h，以5％DMSO＋Sorb 0.4mol/L為冷凍保護劑進行超低溫保存，采用20℃流水沖洗解凍，細胞