芒果mangiferaindical.體細(xì)胞胚胎發(fā)生及胚性培養(yǎng)物超低溫保存的研究_第1頁(yè)
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1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文芒果( M a n g i f e m i n d i c aL .) 體細(xì)胞胚胎發(fā)生及胚性培養(yǎng)物超低溫保存的研究作者:吳永杰導(dǎo)師:黃學(xué)林教授專(zhuān)業(yè):植物學(xué)各辯孌員會(huì)( 簽名)主席:例踢 委員2 確一’/、/,f l 氣∥鵜販喟 ;辯中山大學(xué)生命科學(xué)院中國(guó)·廣州5 1 0 2 7 52 0 0 5 年1 0 月芒果體細(xì)胞胚胎發(fā)生及胚性培養(yǎng)物超低溫保存的研究 吳永杰 中山博士大學(xué)學(xué)位論文面與培養(yǎng)基接觸的表皮細(xì)胞

2、誘導(dǎo)獲得,而珠心組織的兩側(cè)表皮細(xì)胞均可誘導(dǎo)胚性培養(yǎng)物。無(wú)論是子葉還是珠心組織為外植體,紫花芒的體胚發(fā)生能力( 2 8 .4 和1 2 .O %)均高于紅芒( 1 4 .4 和4 .0 %) 。對(duì)同一基因型來(lái)說(shuō),子葉的體胚發(fā)生能力高于珠心組織。連續(xù)三年的實(shí)驗(yàn)表明,子葉外植體均保持了較穩(wěn)定的體胚發(fā)生能力,而珠心組織只在其中一年誘導(dǎo)獲得了體胚發(fā)生。同時(shí)誘導(dǎo)獲得的胚性培養(yǎng)物可轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基上穩(wěn)定的增殖和保存。在懸浮培養(yǎng)條件下,胚性培養(yǎng)物可快速增

3、殖并完全同步于原胚階段。組織學(xué)觀察表明胚性培養(yǎng)物細(xì)胞保持了明顯的胚性特征。增殖的胚性培養(yǎng)物在轉(zhuǎn)到體胚成熟誘導(dǎo)培養(yǎng)基上后可直接經(jīng)體胚發(fā)生形成正常的子葉胚,并進(jìn)一步萌發(fā)形成再生植株。首次報(bào)道了紫花芒和紅芒胚性培養(yǎng)物的超低溫保存技術(shù)。研究表明芒果胚性培養(yǎng)物可以采用直接干燥法或玻璃化法進(jìn)行超低溫保存。采用直接干燥法脫水處理1小時(shí),胚性培養(yǎng)物的含水量就降至5 8 %,在超低溫保存后的存活率為8 .3 %。然而進(jìn)一步延長(zhǎng)脫水處理時(shí)間卻造成了對(duì)胚性培

4、養(yǎng)物的致命傷害。玻璃化法對(duì)芒果胚性培養(yǎng)物的脫水速率最高,保護(hù)作用也是最好的。在脫水處理1 5 分鐘后,其含水量迅速降至4 0 %,超低溫保存后得到了9 1 %的存活率。本實(shí)驗(yàn)中材料生理狀態(tài)的調(diào)控是超低溫保存成功的另一個(gè)重要因素。處于指數(shù)生長(zhǎng)期的胚性培養(yǎng)物在超低溫保存后的存活率均高于緩慢生長(zhǎng)期。同時(shí)與固體培養(yǎng)的胚性培養(yǎng)物相比,由于懸浮培養(yǎng)的胚性培養(yǎng)物具有很高的同步性,組織均一性好,所以其超低溫保存后的存活率也更高。本研究表明芒果胚性培養(yǎng)物

5、超低溫保存的最佳程序?yàn)椋哼x取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的快速增殖的胚性培養(yǎng)物( 懸浮培養(yǎng)) 為試材,用低溫保護(hù)劑P V S 3 ( 5 0 %蔗糖+ 5 0 %甘油) 脫水處理1 5 - 3 0 分鐘后,更換新鮮的低溫保護(hù)劑溶液,隨后將胚性培養(yǎng)物直接投入液氮超低溫保存?;瘍龊蟮呐咝耘囵B(yǎng)物在固體增殖培養(yǎng)基上再培養(yǎng),約1 7天后即可觀察到新的胚性培養(yǎng)物再生,胚性培養(yǎng)物的存活率最高可達(dá)1 0 0 %。為驗(yàn)證離體和超低溫保存的安全性,對(duì)離體培養(yǎng)和超低溫保存

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