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文檔簡介
1、本研究以百子蓮胚性愈傷組織為試驗(yàn)材料,通過試驗(yàn)得出以下結(jié)論:
(1)建立了百子蓮胚性愈傷組織的玻璃化法超低溫保存體系。取繼代培養(yǎng)20 d后的百子蓮胚性愈傷組織50±10 mg,在4℃低溫條件下、0.5 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2d,然后在室溫下將250±10 mg胚性愈傷組織放入含2mL裝載液的冷凍管中處理60min,去除裝載液后,在0℃條件下放入2 mL玻璃化溶液(PVS2)處理40 min,快速投入液氮1h后,于
2、40℃水浴中解凍90 s,快速吸除PVS2溶液后,用去裝載液洗滌3次,每次間隔10 min,置于恢復(fù)培養(yǎng)基上24 h后,測定細(xì)胞成活率(TTC)達(dá)56.9%,胚性愈傷組織能夠正常增殖。
(2)利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對恢復(fù)培養(yǎng)55 d后的百子蓮胚性愈傷組織遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評價。采用8個正向引物和8個反向引物組合成64對組合,對隨機(jī)選取的供試樣品進(jìn)行了AFLP分析,結(jié)果表明經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后,共分離得到3086個條
3、帶,其中有6個差異條帶,變異率低于1%。
(3)研究了百子蓮胚性愈傷組織玻璃化法超低溫保存過程中含水量、相對電導(dǎo)率、丙二醛質(zhì)量摩爾濃度、可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化規(guī)律,并對各生理指標(biāo)之間以及生理指標(biāo)與細(xì)胞成活率之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:在投入液氮冷凍前,含水量顯著降低到41.5%,恢復(fù)培養(yǎng)24 h后,含水量迅速回升;相對電導(dǎo)率與丙二醛的變化規(guī)律相一致,均從預(yù)培養(yǎng)到快速解凍過程中持續(xù)上升,至恢復(fù)培養(yǎng)24h后
4、緩慢下降;可溶性糖含量呈雙峰曲線變化;淀粉和可溶性蛋白含量的變化趨勢相似,均呈先下降,后上升,再下降的變化。多元相關(guān)分析表明:相對電導(dǎo)率與丙二醛呈顯著正相關(guān);細(xì)胞存活率與相對電導(dǎo)率呈極顯著負(fù)相關(guān),與丙二醛呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.999和-0.896。說明在百子蓮胚性愈傷組織玻璃化法超低溫保存過程中,膜質(zhì)傷害對細(xì)胞成活率的影響最大。
(4)添加外源抗氧化劑對提高細(xì)胞成活率至關(guān)重要。與不添加的對照相比,褪黑素、脫落酸、谷
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